側(cè)溝爬巖鰍人工繁殖和胚胎發(fā)育初步研究

譚剛 吳毅 何興恒 安義民 陳凡剛

摘要：2017年6月至2018年4月，在大渡河黑馬魚類增殖站進(jìn)行了側(cè)溝爬巖鰍（Beaufortia liui）的人工繁殖和胚胎發(fā)育初步研究。結(jié)果表明，側(cè)溝爬巖鰍為底棲、雜食性魚類，晝伏夜出。其繁殖季節(jié)為2—4月，成熟卵呈卵圓形，卵徑約0.8 mm，淡黃色，微黏性。受精后約15 min卵膜吸水膨脹至最大，卵徑約1.2 mm。在水溫（17±0.5） ℃下歷時60 h 55 min，積溫974.56 ℃·h，經(jīng)過7個階段完成胚胎發(fā)育。仔魚出膜6 d開口，出膜45 d，仔魚的胸鰭和腹鰭完全特化，其體型與成魚基本相同。

關(guān)鍵詞：側(cè)溝爬巖鰍（Beaufortia liui）;人工繁殖;胚胎發(fā)育;大渡河

中圖分類號：S966.4 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）24-0150-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.036 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Preliminary study on artificial reproduction and embryo development of Beaufortia liui

TAN Gang1，WU Yi1，HE Xing-heng1，AN Yi-min2，CHEN Fan-gang1

（1.Sichuan Aquabase Biotechnology Co.，Ltd.，Chengdu 610000，China;

2.Guodiandaduhezhentouba Hydropower Construction Co.，Ltd.，Leshan 614700，Sichuan，China）

Abstract： From June 2017 to April 2018， Experiment of artificial reproduction embryo development of Beaufortia liui in the Dadu river black horse fish breeding station. The results showed that it was omnivorous fish and benthic like nocturnal. The breeding season was from February to April， the mature eggs were oval， the egg diameter was about 0.8 mm， and the yellowish， slightly sticky. About 8 minutes after fertilization， the egg membrane swelled to the maximum， and the egg diameter was about 1.2 mm. At a water temperature of （17±0.5） ℃ for 60 h 55 min， the accumulated temperature of 974.56 ℃·h. Embryo development was completed in seven stages. After 6 days， the seedlings began to eat. The pectoral and ventral fins of the larvae were completely specialized after 45 d of film emergence， and their body shape was basically the same as that of adult fish.

Key words： Beaufortia liui; artificial reproduction; embryonic development; Dadu river

側(cè)溝爬巖鰍（Beaufortia liui）屬于鯉形目（Cypriniformes）爬鰍科（Balitoridae）爬巖鰍屬（Beaufortia），主要分布于岷江、大渡河及金沙江流域[1]。隨著人類活動的增加、水利工程的修建、生態(tài)環(huán)境的破壞等因素，致使側(cè)溝爬巖鰍的生境分布區(qū)域和野外生物量逐年減小。目前，有關(guān)側(cè)溝爬巖鰍的研究僅有其形態(tài)分類的文獻(xiàn)記載[1，2]。本研究于2017年6月至2018年4月，對側(cè)溝爬巖鰍的人工繁殖和胚胎發(fā)育進(jìn)行了初步研究，旨在探索側(cè)溝爬巖鰍的人工繁殖和胚胎發(fā)育規(guī)律，為小型爬鰍科魚類的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 ?材料與方法

1.1 ?親魚的馴養(yǎng)與培育

本研究所用的側(cè)溝爬巖鰍親魚采集于大渡河和金沙江流域，共采集到680尾野生親魚。野生親魚在室內(nèi)的仿生馴養(yǎng)池進(jìn)行馴養(yǎng)，馴養(yǎng)分為三個階段進(jìn)行：第一階段，主要進(jìn)行野生親魚投喂開口餌料的馴養(yǎng);第二階段，主要進(jìn)行飼喂人工合成餌料的馴養(yǎng);第三階段，主要進(jìn)行人工環(huán)境適應(yīng)性的馴養(yǎng)。

通過3～4個月的人工馴養(yǎng)，側(cè)溝爬巖鰍可在室外進(jìn)行親魚強化培育。選擇體表無傷、體重1.2 g以上雄魚和2.0 g以上的雌魚作為后備親魚進(jìn)行培育。將后備親魚投放到室外水泥池中進(jìn)行培育，池底鋪一層鵝卵石，用流水養(yǎng)殖，養(yǎng)殖密度為10尾/m2。每天定時觀察其生活習(xí)性和生長狀況，做好殘余餌料和排泄物的處理，并及時進(jìn)行病害預(yù)防。日常馴養(yǎng)培育時，控制魚池的進(jìn)水量為0.3 m/s，pH為6.7～7.8、溶解氧為10.5～12.0 mg/L、水溫為15～20 ℃。

1.2 ?人工繁殖

依據(jù)側(cè)溝爬巖鰍的繁殖生物學(xué)測定數(shù)據(jù)，每尾雌魚平均重量為3.5 g。用3.5%的生理鹽水配制催產(chǎn)劑，催產(chǎn)劑量為HCG 100～300 IU+LHRH-A2 6～10 μg/kg。采用一針注射法，從胸鰭基部靠近腹腔處以45°注射催產(chǎn)藥物，進(jìn)針深度約為0.10 cm;雌魚注射10 h 后，給雄魚注射催產(chǎn)藥物，催產(chǎn)劑量減半。注射完后，將親魚放回暫養(yǎng)池內(nèi)，保持水溫（17.0±0.5） ℃，控制水流速度0.3 m/s。

雌魚注射藥物10 h后，定時檢查，當(dāng)輕輕擠壓雌魚腹部有卵從泄殖孔中順利流出即可擠卵;以紙巾擦拭尾部表面多余的水分，將成熟的卵擠入干燥的培養(yǎng)皿中。輕輕擠壓雄魚腹部從泄殖孔有乳白色精液流出，用生理鹽水將其沖洗到盛有卵子的培養(yǎng)皿中，并輕輕用手晃動培養(yǎng)皿10～15 s后靜置30 s，獲得受精卵。將受精卵平鋪在燒杯中，再將燒杯放置在玻璃魚缸中進(jìn)行孵化，控制水溫在（17±0.5） ℃，保持微流水。

1.3 ?胚胎和仔魚發(fā)育觀察

用XTZ-EAS體視解剖鏡對側(cè)溝爬巖鰍胚胎發(fā)育進(jìn)行觀察。用華谷動力相機(jī)Demo Cam軟件收集胚胎發(fā)育各個時期的照片及錄像。仔魚發(fā)育采用尼康單反相機(jī)（D7100）和微距鏡頭（Tamron SP AF 90 mm F/2.8）進(jìn)行定時觀察拍攝記錄。胚胎發(fā)育和仔魚發(fā)育水溫為16～18 ℃。

胚胎發(fā)育的積溫（℃·h）=胚胎發(fā)育時間（h）×發(fā)育時水溫（℃）[3]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?生活習(xí)性與繁殖特性

側(cè)溝爬巖鰍為底棲、雜食性魚類，晝伏夜出，應(yīng)急反應(yīng)敏捷。白天多隱藏在鵝卵石下或陰暗處的水泥池壁上，借助其特化的胸鰭和腹鰭吸附在卵石和魚池壁的表面。20：00左右開始出來活動覓食，此時側(cè)溝爬巖鰍能夠快速敏捷在水體中游動。覓食時依靠胸鰭匍匐前進(jìn)，利用其角質(zhì)化的下頜刮食固著的藻類和捕捉水體底層及水草周圍的無脊椎動物，如搖蚊幼蟲和水蚯蚓等。在動物性食物充足時偏食無脊椎動物，僅采食少量藻類;當(dāng)動物性食物匱乏時，就采食藻類植物。

根據(jù)野外調(diào)查和人工馴養(yǎng)的觀察，側(cè)溝爬巖鰍的繁殖季節(jié)為2—4月，且不同流域其繁殖時間略有不同。金沙江流域，其繁殖時間為2—3月;大渡河流域，其繁殖時間在3—4月。側(cè)溝爬巖鰍的成熟卵呈卵圓形，卵徑約0.8 mm，淡黃色。受精卵具微黏性，其黏性隨時間逐漸消失;受精卵遇水后卵膜徑約1.2 mm，卵粒中不含油粒，在靜水或微流水環(huán)境中多數(shù)會沉入水底，少部分吸附在容器壁上，并且卵粒之間不相互黏連，當(dāng)有稍強流水沖擊的情況下會隨著水流而動，使卵表面容易黏附雜質(zhì)和小氣泡。

2.2 ?胚胎發(fā)育

側(cè)溝爬巖鰍胚胎發(fā)育在（16～18） ℃下歷時60 h 55 min，積溫974.56 ℃·h。側(cè)溝爬巖鰍胚胎發(fā)育過程與其他鯉科魚類相同，經(jīng)過7個階段，胚胎發(fā)育時序見表1、圖1。

2.2.1 ?胚盤隆起期 ?受精后10 min，受精卵逐漸吸水膨脹;受精后23 min，卵膜徑達(dá)到最大;35 min后，受精卵原生質(zhì)逐漸向著動物極移動，卵黃向著植物極移動，胚盤形成;1 h 14 min后胚盤達(dá)到最大，高度約占卵黃的1/5～1/4。

2.2.2 ?卵裂期 ?1 h 52 min后，受精卵胚盤開始進(jìn)行第一次分裂，從細(xì)胞中間開始徑向分裂，并形成兩個細(xì)胞，進(jìn)入2細(xì)胞期;2 h 36 min后，胚盤開始進(jìn)行第二次分裂，與第一次分裂方向垂直，分裂4個細(xì)胞，進(jìn)入4細(xì)胞期;3 h 05 min后，胚盤開始發(fā)生第三次分裂，分裂方向與第一次分裂平行，分裂成2排，每排4個細(xì)胞，下邊4個細(xì)胞略大于上邊4個，進(jìn)入8細(xì)胞期;5 h 48 min后，胚盤開始發(fā)生第四次分裂，分裂方向與第二次分裂平行，分裂成排成4排，每排4個細(xì)胞，中間4個細(xì)胞略微大于周圍的細(xì)胞，并進(jìn)入16細(xì)胞期;6 h 40 min后，胚盤發(fā)生第五次分裂，分裂方向與第一次分裂平行，分裂成4排，每排8個大小相似的細(xì)胞，進(jìn)入32細(xì)胞期;隨著細(xì)胞分裂的不同步，細(xì)胞層數(shù)開始堆疊，數(shù)目逐漸增多、大小逐漸減小，8 h 12 min后，進(jìn)入桑葚胚期，胚盤的一端開始逐漸形成隆起的多細(xì)胞胚體，如同桑葚，故稱為桑葚胚期。

2.2.3 ?囊胚期 ?10 h 10 min后，胚體細(xì)胞逐漸分裂使細(xì)胞層在卵黃上部明顯隆起，囊胚高度約占卵黃的1/2，受精卵進(jìn)入囊胚早期;11 h 30 min后，胚層高度降低、開始向卵黃周圍進(jìn)行移動，開始形成囊胚腔，受精卵進(jìn)入囊胚中期;13 h 12 min后，胚層開始下包、高度逐漸降低，細(xì)胞層在卵黃上的隆起變得不再明顯，受精卵進(jìn)入囊胚晚期。

2.2.4 ?原腸胚期 ?15 h 05 min后，開始出現(xiàn)胚環(huán)，胚層開始下包約1/3，側(cè)面可見胚層細(xì)胞背唇呈新月狀，胚盤邊緣伴隨著胚層細(xì)胞內(nèi)卷形成胚環(huán)，受精卵進(jìn)入原腸早期;受精后17 h 35 min，胚層向下包裹至卵黃的1/2，此時在胚環(huán)的一定部位內(nèi)卷形成三角形隆起，受精卵進(jìn)入原腸中期。受精后19 h 15 min，胚層細(xì)胞向下包裹至卵黃的2/3，背唇逐漸明顯，開始形成胚體，此時受精卵進(jìn)入原腸晚期。

2.2.5 ?神經(jīng)胚期 ?21 h 20 min后，胚層細(xì)胞繼續(xù)向下包裹至卵黃的3/4至5/6以上，進(jìn)入神經(jīng)胚期;隨著胚層細(xì)胞繼續(xù)向下包裹;23 h 35 min后，胚孔徹底閉合，胚胎背面開始形成神經(jīng)版，受精卵進(jìn)入胚孔封閉期;26 h 18 min后，開始出現(xiàn)柱狀的脊索，并逐漸形成胚體。

2.2.6 ?器官形成期 ?30 h 30 min后，胚體頭部明顯凸起，形成腦泡，腦泡的兩側(cè)出現(xiàn)一對橢圓隆起，為眼的原基，受精卵進(jìn)入眼基出現(xiàn)期。

2.2.7 ?出膜前期 ?60 h 55 min后，受精卵進(jìn)入出膜期，出膜時胚體尾部先破膜而出，頭部還留在卵膜內(nèi)，隨后卵膜逐漸塌陷，幼苗開始脫落，在容器底部擺動，具有較大的卵黃囊。68 h 15 min后，所有受精卵完成脫膜。

2.3 ?仔魚發(fā)育

剛出膜仔魚通體透明無色素積累，卵黃囊前段膨大呈圓球狀，后段呈長細(xì)棒狀緊貼魚體腹部，卵黃囊全長約占仔魚全長的3/4;初孵仔魚，大部分在容器底部平躺，時而依靠尾部擺動。

仔魚出膜后3 d，開始出現(xiàn)胸鰭，細(xì)長緊貼在魚體兩側(cè)，心臟跳動明顯，血液透明且涌動明顯。

仔魚出膜后6 d，仔魚的卵黃囊基本吸收完畢。仔魚頭部和背部出現(xiàn)大量的黑色素，心臟和血管隱約可見，開始靠尾部擺動在容器底部游動但范圍較小，胸鰭發(fā)育快速呈扇葉狀，開始取食煮熟的雞蛋黃粒。

仔魚出膜后8 d，仔魚胸鰭發(fā)育成長條形，背鰭、腹鰭開始發(fā)育，仔魚身體黑色素明顯。當(dāng)有外界刺激時，依靠胸鰭和尾鰭在容器底部游動，游動范圍小且主要在水體底部游動，開始主動取食幼體輪蟲和幼體枝角類。

仔魚出膜后15 d，仔魚的胸鰭和腹鰭還未特化。仔魚呈現(xiàn)頭部大，身體細(xì)長，當(dāng)有外界刺激時主要沿著容器壁游動，開始取食稍大的枝角類和藻類。

仔魚出膜后25 d，仔魚的胸鰭和腹鰭還未完全特化。仔魚體色呈現(xiàn)淡黃色或青色，頭后身體逐漸變寬，呈梭形，并開始匍匐于卵石和容器壁上。

仔魚出膜后45 d，仔魚的胸鰭和腹鰭完全特化，身體上的斑紋明顯，體型與成魚基本相同。側(cè)溝爬巖鰍仔魚發(fā)育過程見圖2。

3 ?討論

與已報道的其他爬鰍科魚類相同，側(cè)溝爬巖鰍的受精卵屬于漂流性卵[4]。但側(cè)溝爬巖鰍的卵徑（1.2 mm）要小于犁頭鰍（5.34 mm）[5]和四川華吸鰍（1.85 mm）[6]，并且黏性也比犁頭鰍和四川華吸鰍弱。

影響側(cè)溝爬巖鰍胚胎發(fā)育的主要因素是水溫。整個發(fā)育過程中需要保持水溫在16～18 ℃，受精卵經(jīng)過60 h 55 min胚胎發(fā)育，開始出膜。在水溫16～18 ℃范圍內(nèi)側(cè)溝爬巖鰍的受精卵出膜率達(dá)到最高，畸形率最低，幼苗出膜后，存活率較高;當(dāng)水溫在19～22 ℃時，胚胎發(fā)育到囊胚期用時較短，但開始出現(xiàn)大量死亡，出膜率較低并且畸形苗出現(xiàn)較高;當(dāng)水溫小于16 ℃時，胚胎進(jìn)入原腸胚期時就開始出現(xiàn)大量死亡，出膜率最低。本研究表明側(cè)溝爬巖鰍在水溫16～18 ℃時，較為適合其正常的胚胎發(fā)育。吳金明等[6]對赤水河四川華吸鰍的胚胎發(fā)育進(jìn)行了研究，表明其在水溫26.3～27.8 ℃下，受精卵經(jīng)過22 h 34 min的胚胎發(fā)育，開始出膜，仔魚經(jīng)過65 d發(fā)育成成魚體型;熊玉宇等[5]對犁頭鰍的胚胎發(fā)育進(jìn)行了研究，表明其在水溫26.3～27.8 ℃下，受精卵經(jīng)過34 h的胚胎發(fā)育，開始出膜，仔魚經(jīng)過56 d發(fā)育成成魚體型。李恒德[7]對金沙江犁頭鰍的胚胎發(fā)育研究表明，其在水溫17.5～21.0 ℃下，受精卵經(jīng)過57 h 48 min的胚胎發(fā)育，開始出膜。大渡河側(cè)溝爬巖鰍的胚胎發(fā)育時間與金沙江犁頭鰍較為接近，胚胎發(fā)育溫度范圍卻比其要窄，并且側(cè)溝爬巖鰍仔魚發(fā)育的速度要快于四川華吸鰍和犁頭鰍，這可能與側(cè)溝爬巖鰍生存環(huán)境、水流、溶解氧以及卵黃的大小等因素有關(guān)。

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