云南地區(qū)月季灰霉病病原菌的分離鑒定

張雙艷，孟靜，韓洋琳，吳紅芝

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，昆明650201）

月季（Rosa hybridaL.）屬于薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）植物，以其品種多、花色艷、形態(tài)美、花期長等特點深受人們喜愛，有“花中皇后”的美稱。月季切花居世界五大切花之首，其盆花和綠籬的應(yīng)用也十分流行，同時也是多種高級食品、化妝品的重要香料原料，具有重要的經(jīng)濟價值。切花作為月季的主要產(chǎn)品形式，其采后品質(zhì)直接決定了月季的觀賞和經(jīng)濟價值。近年來，隨著月季種植面積的擴大和溫室大棚月季的大量增長，月季病害日益嚴重，成為影響月季采后品質(zhì)的重要因素。其中灰霉病是月季生產(chǎn)中常見且危害較嚴重的一種真菌性病害，花、葉、莖均可發(fā)病，由于其在低溫高濕條件下生存與繁殖力很強[1]，已成為月季采后最嚴重的病害，被稱為月季切花采后的“癌癥”。

灰霉病是由葡萄孢屬真菌（Botrytisspp．）引起的死體營養(yǎng)型真菌病害，其病原菌是一種兼性寄生病菌，屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗叢梗孢科、葡萄孢屬[1]。灰霉病是露地、保護地作物中常見的一種真菌性病害。當(dāng)溫度和濕度適宜時，寄主植物表面的分生孢子萌發(fā)長出芽管并分化發(fā)育成菌絲，通過氣孔和傷口或分泌一些細胞壁降解酶穿過寄主表皮，進入寄主組織，引起組織軟化、腐爛，后期在寄主表面產(chǎn)生大量的無性分生孢子進行再次侵染[2-3]，也可以通過產(chǎn)生一系列不同的毒素來降低植物抵抗感染的能力，以達到侵染的目的[4]。在惡劣的條件下，大量的菌絲體相互扭結(jié)，形成表皮比較堅硬的菌核，可抵御不利的生存環(huán)境，一旦條件適宜，便能直接產(chǎn)出分生孢子，恢復(fù)感染周期，在灰霉病的病害循環(huán)中起重要作用[5]。

云南是中國70%以上月季切花的生產(chǎn)基地，也是全球重要的月季切花生產(chǎn)地，該地區(qū)栽培月季的時間長、規(guī)模大、種類豐富，為月季灰霉病的發(fā)生和不同病菌的生存提供了良好的條件。從昆明花拍中心和云南地區(qū)月季種植農(nóng)戶處調(diào)查得知，灰霉病對月季切花采后造成嚴重危害，直接影響了月季切花的采后品質(zhì)和價格，月季灰霉病成為花拍中心和月季種植戶亟待解決的問題。但關(guān)于云南地區(qū)月季灰霉病的研究尚未見報道；因此，本研究從云南18個月季切花產(chǎn)區(qū)采集月季灰霉病樣本，采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察和現(xiàn)代分子技術(shù)相結(jié)合的方法對病原分離物進行鑒定，以確定引起云南地區(qū)月季灰霉病的病原菌種類和特征，研究結(jié)果可為月季灰霉病的防治提供重要支撐。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集和病原菌的分離與純化

從云南18 個月季切花生產(chǎn)基地采集帶有典型灰霉病病斑的月季花瓣、葉或嫩莖，裝在自封袋里，標(biāo)上切花品種、采集日期和采集地，帶回實驗室，保存在4 ℃冰箱中，待分離。用澆注平板法對采集的病樣進行分離、純化[6-7]。切取病樣發(fā)病部位放入5 mL 離心管中，加入2 mL 無菌水，充分振蕩，然后按1×10－1、1×10－2、1×10－3、1×10－4、1×10－5、1×10－6濃度梯度稀釋，取1×10－4、1×10－5、1×10－6菌液各200 μL注入滅菌培養(yǎng)皿中，然后倒入15～20 mL 冷卻至45～50 ℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基，水平搖晃均勻，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)。將接種好的培養(yǎng)皿倒置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，將獲得的分離物多次純化后得到目標(biāo)菌株。在超凈工作臺上用直徑6 mm的滅菌打孔器在培養(yǎng)3 d 的菌落邊緣打取菌餅，放入裝有1.8 mL 20%甘油的凍干管中，每管保存3個菌餅，于4 ℃冰箱中保存24 h 后，再放入－20 ℃冰箱中凍藏，待凝固后轉(zhuǎn)移至－80 ℃冰箱中保存[8]。

1.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將保存的菌株在PDA 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3 d后，用直徑6 mm 的滅菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅，轉(zhuǎn)接到新的PDA 中，每皿1 個菌餅，每個菌株3個重復(fù)，分別測量24 h和48 h菌落的直徑，計算菌絲生長速度，觀察菌落的形狀、顏色及菌核和分生孢子的產(chǎn)生等，15 d 后計算菌核產(chǎn)量和測量菌核直徑。菌絲生長速度=（48 h菌落直徑－24 h菌落直徑）/2。

菌株的顯微特征觀察采用蓋玻片插片培養(yǎng)法[9]。將病原菌制成孢子懸浮液，用澆注平板法將菌液接種在培養(yǎng)皿中，然后將滅過菌的蓋玻片按約45 ℃角斜插在凝固的培養(yǎng)基上，20 ℃黑暗培養(yǎng)7～10 d 后，用鑷子將蓋玻片取下，放置在載玻片上，置于顯微鏡下觀察。

1.3 病原菌的分子鑒定

根據(jù)菌落形態(tài)的多樣性，結(jié)合樣本來源，從每個月季切花產(chǎn)區(qū)選擇4～6個代表菌株共88個菌株進行分子生物學(xué)鑒定。將保存的代表菌株在PDA上20 ℃活化培養(yǎng)6～8 d后刮取菌絲，用液氮充分研磨，然后用Hipure 真菌DNA 迷你試劑盒（美基生物科技有限公司）提取DNA。對代表菌株的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS、依賴RNA 的DNA 聚合酶Ⅱ亞基基因RPB2進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴增和測序，引物合成和擴增產(chǎn)物測序均由昆明碩擎生物科技有限公司完成。引物序列信息見表1。

PCR 反應(yīng)體系（25 μL）[12]：2×RapidTaq預(yù)混液12.5 μL，正、反向引物各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 補充至25 μL。PCR 反應(yīng)程序[12]：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃（ITS）或56 ℃（RPB2）退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。

測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行BLAST 比對，用Geneious 8.0 軟件對自測序列和從GenBank 上下載的相關(guān)序列進行比對和修飾，用SequenceMatrix-Windows-1.8 軟件對2 段基因序列進行拼接處理。以核盤菌屬（Sclerotinia sclertiorum）和 叢 梗 孢 屬（Monilinia fructicola）作為外群，通過MEGA 7.0 軟件，利用鄰接法進行聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，自展支持率分析采用1 000次重復(fù)。

表1 引物序列信息Table1 Information of primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 云南地區(qū)月季灰霉病的癥狀

月季灰霉病在月季生長的各個時期均可發(fā)生，云南地區(qū)每年3—4 月天氣轉(zhuǎn)暖和8—10 月雨季時是月季灰霉病的高發(fā)期，莖、葉、花均可發(fā)病，其中花瓣發(fā)病最為嚴重。嫩莖和花蕾受侵染時，病斑呈黑褐色，阻止嫩莖生長和花蕾開放，最后整個受侵部位變褐枯死。當(dāng)侵害葉片時，在葉緣或葉尖處往往出現(xiàn)暗綠色水漬狀斑塊（如開水燙傷），并不斷向葉內(nèi)擴展直至腐爛?；ò瓯磺秩境跗冢糠只ò瓿霈F(xiàn)玫紅色、褐色或白色斑點（隨月季品種而不同），然后斑點進一步擴大，漸漸變成水漬狀或變褐皺縮、腐?。▓D1）。在溫暖潮濕的環(huán)境下，灰色霉層即分生孢子可以完全長滿受侵染部位。

2.2 病原菌的形態(tài)特征

本實驗從云南昆陽、晉寧、安寧、石林、彌勒等地的18 個月季切花產(chǎn)區(qū)月季上采集了206 個灰霉病樣，根據(jù)菌落形態(tài)特征、分生孢子梗及分生孢子形態(tài)，分離到124個灰霉病病原菌。

如圖2 所示，病原菌在PDA 培養(yǎng)基上20 ℃恒溫、黑暗培養(yǎng)15 d后，菌落特征表現(xiàn)出明顯的差異，根據(jù)菌落形態(tài)特征，將供試菌株分成3種類型：菌絲型、孢子型和菌核型。菌絲型有48 個菌株，生長初期菌絲從無色到白色，放射狀生長，3～5 d后可覆蓋全皿，有少量氣生菌絲，培養(yǎng)至15 d 沒有分生孢子或很少有分生孢子產(chǎn)生，沒有菌核產(chǎn)生。孢子型有35 個菌株，生長初期菌絲從無色到灰白色，放射狀或放射狀同心圓生長，3～4 d 后可長滿培養(yǎng)皿，7～10 d時產(chǎn)生大量氣生菌絲，同時產(chǎn)生大量分生孢子，以同心圓分布或覆蓋全皿；分生孢子梗蓬松，單生或叢生，具橫隔，多數(shù)在梗中上部任意分支，或頂端任意分支，分支末端膨大，其上著生大量分生孢子，分生孢子形態(tài)可分為近圓形、卵圓形和長瓜子型，無色至淡褐色（圖3）；培養(yǎng)至15 d 時沒有菌核產(chǎn)生或產(chǎn)生少量菌核并常被菌絲和孢子覆蓋。菌核型有41 個菌株，生長初期菌絲從無色到灰白色，放射狀或放射狀同心圓生長，3～6 d可覆蓋全皿，有少量氣生菌絲產(chǎn)生；培養(yǎng)至10 d 左右開始產(chǎn)生大量菌核，菌核以同心輪紋狀排列、沿培養(yǎng)皿邊緣分布或散亂分布在培養(yǎng)皿中，其中以同心輪紋狀排列的菌核通常較大；菌核以黑色居多，41 株菌核型菌株中只分離到1 株黃色菌核菌株，菌核大?。?.6～12.3）mm×（1.6～9.9）mm，每皿（32±5）個菌核；沒有分生孢子或很少有分生孢子產(chǎn)生。

圖1 月季灰霉病癥狀Fig.1 Symptoms of rose gray mold

圖2 云南地區(qū)不同月季灰霉菌培養(yǎng)3、15 d的菌落特征Fig.2 Colony characteristics of different pathogenic fungi of rose gray mold cultured for 3 and 15 days in Yunnan area

2.3 病原菌的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

對88個代表菌株的ITS、RPB2基因進行擴增和測序，分別得到長度約為500 bp和1 100 bp的片段，部分擴增結(jié)果如圖4 所示。在GenBank 中利用BLAST 進行同源性比對，結(jié)果表明：87 株菌株的2個基因片段與B.cinerea基因相似性均在99%以上，1 株菌株（SLJY-BLZ-2）的2 個基因片段與B.fabae相似性均在99% 以上。將測得的序列與從GenBank 上獲取的其他葡萄孢屬真菌進行ITS和RPB2基因序列分析，并以核盤菌屬（Sclerotinia sclertiorum）和叢梗孢屬（Monilinia fructicola）真菌作為外群構(gòu)建聯(lián)合基因系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示：上述87株菌株與B.cinerea聚為一支，SLJY-BLZ-2與B.fabae聚為一支（圖5），自展支持率分別是76%和85%。因此，結(jié)合病原菌的形態(tài)特征，可以確定采集到的88 個侵染云南地區(qū)切花月季的病原菌為B.cinerea和B.fabae。?

圖3 云南地區(qū)月季灰霉病病原菌的顯微特征Fig.3 Microscopic characteristics of rose gray mold pathogens in Yunnan area

圖4 ITS、RPB2引物對云南地區(qū)月季灰霉病病原菌的PCR擴增結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of rose gray mold pathogens in Yunnan area by ITS and RPB2 primers

3 討論與結(jié)論

灰霉病是由葡萄孢屬真菌（Botrytisspp.）引起的一類重要病害，Botrytisspp.是一類在世界范圍分布的病原真菌，寄主范圍廣，其中B.cinerea可以侵染586 屬1 400 種植物，其他種的寄主范圍較窄[13]；B. fabae主要侵染蠶豆，也能侵染幾種其他的豆科植物[14]，暫未見到從月季上分離到B.fabae的報道。本研究從月季切花上分離得到1株B.fabae菌株，這是從月季上分離到B.fabae的首次報道。

葡萄孢屬真菌屬內(nèi)包含的種比較多，現(xiàn)在國際上廣泛認可的是Henneber（t1973）分類系統(tǒng)，該系統(tǒng)將葡萄孢屬真菌歸納為23 個種。病原菌的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定主要依據(jù)形態(tài)特征和其對寄主的專性化，但是形態(tài)特征容易因環(huán)境的改變而變化，有些葡萄孢菌寄主范圍比較廣泛，并且屬內(nèi)種與種之間的特征比較相似[15]，單靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的方法很難準確鑒定引起月季灰霉病的病原菌。本研究通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)手段鑒定出的B.fabae病菌在菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)及菌落特征上與B.cinerea沒有顯著差異，充分證實了分子輔助鑒定的必要性。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)鑒定方法結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法能更加準確地鑒定病原菌。ITS區(qū)域已被廣泛地應(yīng)用于真菌種類的鑒別，但因其序列較短且在種內(nèi)不同菌株間高度保守，提供的信息量較少，所以并不能很好地區(qū)分菌株之間的親緣關(guān)系[12,15-16]。STAATS等通過對葡萄孢屬真菌的功能基因RPB2、HSP60和G3PDH進行序列分析發(fā)現(xiàn)，這些基因存在足夠的變異，能夠鑒定形態(tài)學(xué)上無法區(qū)分的葡萄孢屬的23個種，證實葡萄孢屬中的23個種在基因水平上是獨立的[11]。筆者在初期分析數(shù)據(jù)時曾單獨采用ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，供試菌株與葡萄孢屬的3 個種B.cinerea、B.fabae和B.pelargonii聚為一支，其他幾個種也不能被明顯區(qū)分開。因此，本研究采用ITS和RPB2基因聯(lián)合分析的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示：87 個菌株與B.cinerea聚到單一的進化分支中，支持率達到76%；1 個菌株與B.fabae聚到一個分支上，支持率為85%；葡萄孢屬的其他種也都位于不同的分支上，能夠顯著區(qū)分葡萄孢屬的不同種。由此表明，采用保守的ITS序列聯(lián)合特定的功能基因序列分析能更準確有效地鑒定月季灰霉病病原菌。

圖5 云南地區(qū)月季灰霉病病原分離物的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of gray mold pathogens isolated from roses in Yunnan area

本研究分離到的124株菌株中，經(jīng)培養(yǎng)觀察，只有1株產(chǎn)生黃色菌核，并且持續(xù)培養(yǎng)1個月后，菌核已萌發(fā)產(chǎn)生分生孢子但仍未變色，這與李娜[8]報道的黃色系菌株相符，這也是從月季上發(fā)現(xiàn)黃色灰葡萄孢菌菌核的首次報道。灰葡萄孢菌黑色菌核是由黑色素集聚形成的，ZHOU 等[17]對番茄和草莓上分離到的黃色菌核研究表明，B.cinerea菌核的黑色素形成與環(huán)境適應(yīng)性密切相關(guān)。本研究從侵染月季的灰霉病病原菌中分離獲得的B.cinerea黃色菌核菌株，為進一步研究B.cinerea的菌核顏色與環(huán)境適應(yīng)性的關(guān)聯(lián)，以及B.cinerea對環(huán)境的適應(yīng)機制提供了材料。

本研究用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的88 個菌株中有87 株是B.cinerea，只有1 株是B.fabae，可見引起云南月季切花灰霉病的病原菌主要是B.cinerea。然而，B. cinerea在PDA 培養(yǎng)基上的形態(tài)特征表現(xiàn)出豐富的多樣性，這與國內(nèi)外學(xué)者的研究一致[1,18-20]，可以分為菌絲型、孢子型和菌核型3 種類型[1]，所占比例分別是39%、28%和33%，沒有明顯的優(yōu)勢類型。張靜[1]、李娜[8]、吳小瑤[20]、黃燕等[21]分別在研究湖北灰葡萄孢菌、湖北保護地番茄和草莓在葡萄孢菌、廣州園藝作物灰葡萄孢菌株、灰葡萄孢蠶豆分離物的多樣性時發(fā)現(xiàn)，供試菌株可分為菌絲型、孢子型和菌核型，其中菌核型占絕大多數(shù)。本研究結(jié)果與他們的研究結(jié)果不同，造成這種差異的原因可能與菌株的寄主有關(guān)。上述幾位研究者獲得的灰霉菌菌株分別是從蠶豆、番茄、草莓等不同科屬的植物上分離得到的，而本研究的供試菌株都是從切花月季上分離得到的，具體原因有待進一步研究。