香舒丸急性毒性和長期毒性研究

焦琳娜 付滿玲 海內(nèi)友 蔣寶響 柯慧 徐曉玉

【摘?要】?目的：在動物上評價香舒丸的急性毒性和長期毒性，為臨床安全用藥提供參考依據(jù)。方法：急性毒性試驗中，設置對照組和給藥組，每組各10只雌性小鼠。給藥組以香舒丸能通過灌胃針的最大藥液濃度（7.26 g·mL-1）、小鼠最大灌胃體積（0.04mL·g-1），在24h內(nèi)2次給予小鼠。觀察并記錄給藥后14d內(nèi)的死亡情況、毒性反應、體重、攝食量，觀察期結(jié)束后，檢測血液生化學指標，肉眼檢查各主要臟器組織病變情況，計算臟器系數(shù)和最大給藥量。長期毒性試驗中，設置香舒丸11g·kg-1組、22g·kg-1組、44g·kg-1組和對照組，每組各20只雌性大鼠。連續(xù)給藥13周及恢復4周，記錄大鼠的一般表現(xiàn)、體重、攝食量。給藥及恢復期結(jié)束后，檢測大鼠血液學指標、血液生化學指標，肉眼檢查各主要臟器組織病變情況，計算臟器系數(shù)，并觀察臟器組織病理學變化。結(jié)果：急性毒性試驗中，給藥組小鼠的一般表現(xiàn)正常，體重、攝食量、血液生化學、臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），肉眼檢查各主要臟器組織無明顯病變，小鼠最大給藥量為580.8g·kg-1。長期毒性試驗中，香舒丸3個劑量組給藥13周后及恢復4周后，大鼠的一般表現(xiàn)正常，體重、攝食量、血液學指標及臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。給藥13周后，香舒丸44g·kg-1組Urea顯著升高、Crea顯著降低（P<0.01），但均在本實驗室正常生理值范圍內(nèi)，44g·kg-1組1例腎臟出現(xiàn)輕微礦化;恢復4周，指標恢復正常，其他血生化指標無顯著性改變，香舒丸組臟器或組織未發(fā)生明顯病理改變。結(jié)論：香舒丸對雌性小鼠、大鼠未見明顯的急性毒性及長期毒性，提示香舒丸在臨床推薦劑量下服用是安全的。

【關(guān)鍵詞】?香舒丸;臨床前安全性評價;急性毒性;長期毒性

【中圖分類號】R285.5???【文獻標志碼】 A????【文章編號】1007-8517（2019）24-0027-07

Study on Acute and Long-Term Toxicity of Xiangshu Pill

JIAO Linna1?FU Manling2?HAI Neiyou3?JIANG Baoxiang1?KE Hui1?XU Xiaoyu1*

1.Pharmacology of Chinese Materia Medica， Southwest University， Chongqing 400715， China; 2. Nursing equipment research and development laboratory of Southwest Medical University， Luzhou 646000， China; 3. Luzhou xinkang biotechnology co， Luzhou 646000， China

Abstract：Objective To evaluate the acute toxicity and long-term toxicity of Xiangshu Pill in animals to provide reference for clinical safety drugs.Methods In acute toxicity test， there were control group and administration group and 10 female mice in each group. Mice were administered intragastrically twice within 24 hours. The concentration of Xiangshu Pill in the administration group was 7.26g·mL-1， and the volume was 0.04mL·g-1. Mortality， toxicity， body weight and food intake within 14 days after administration were observed and recorded. After the end of the observation period， blood biochemical indicators were detected， pathological changes of main organs were examined by naked eye， and organ coefficients and maximum dosage were calculated. In long-term toxicity test， there were Xiangshu Pill 11g·kg-1 group， 22g·kg-1 group， 44g·kg-1 group and control group， consisted of 20 female rats in each group. During 13 weeks of continuous administration and 4 weeks of recovery， the general performance， body weight and food intake of rats were recorded. After the administration and recovery period， the hematological and biochemical indexes of rats were detected. The pathological changes of the main organs were examined by naked eye. The organ coefficients were calculated and the histopathological changes of the organs were observed.Results In acute toxicity test， the mice in the administration group showed normal general performance， and there was no significant difference in body weight， food intake， blood biochemistry and organ coefficient（P>0.05）. There was no obvious pathological change in the main organ by naked eye examination. The maximum dosage of the mice was 580.8g·kg-1. In long-term toxicity test， after 13 weeks of administration and 4 weeks of recovery， the rats in the three dosage groups of Xiangshu Pill showed normal general performance. There was no significant difference in body weight， food intake， hematological parameters and organ coefficient （P>0.05）. After 13 weeks of administration， Urea increased significantly and Crea decreased significantly in Xiangshu Pill 44g·kg-1 group（P<0.01）， but within the normal physiological value of the laboratory and one case of kidney in 44g·kg-1 group had slight mineralization. After 4 weeks， the indexes recovered normal， other blood biochemical indicators had no obvious changes， and viscera or tissues in Xiangshu Pill group had no obvious pathological changes. Conclusion Xiangshu Pill had no obvious acute toxicity and long-term toxicity to female mice and rats， suggesting that it was safe to take Xiangshu Pill at the recommended clinical dosage.

Key?words：Xiangshu Pill;Preclinical Safety Evaluation;Acute Toxicity;Long-Term Toxicity

香舒丸，由香附、當歸、漏蘆、王不留行、夏枯草等中藥組成，具有疏肝解郁、活血化瘀、軟堅散結(jié)、理氣鎮(zhèn)痛的功效，主治肝郁氣滯、血瘀痰凝型乳腺增生。該方在臨床上應用二十余年，能夠減輕乳房疼痛、減小乳房腫塊及調(diào)節(jié)性激素水平等，但香舒丸的毒理學研究目前尚無文獻報道。本研究依據(jù)《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》[1]《藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導原則》[2]《藥物重復給藥毒性研究技術(shù)指導原則》[3]等進行香舒丸的急性毒性和長期毒性試驗， 為臨床安全用藥提供實驗依據(jù)。

1?材料

1.1?藥物與試劑?香舒丸，批號K170601，10g/袋，由四川綠葉制藥股份有限公司提供。臨床人每日推薦劑量為22g·60kg-1。用蒸餾水配制香舒丸能通過灌胃針的最大濃度7.26g·mL-1用于急毒試驗中的給藥組;配制濃度為1.1g·mL-1、2.2g·mL-1及4.4g·mL-1分別用于長毒試驗中的香舒丸11g·kg-1、22g·kg-1、44g·kg-1組，此三個劑量分別為臨床推薦劑量的30、60、120倍。

血液生化檢測試劑盒：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，批號：140217011），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，批號：140117013），堿性磷酸酶（ALP，批號：140317009），尿素（Urea，批號：141317010），肌酐（Crea，批號：141017010），總蛋白（TP，批號：140817009），白蛋白（ALB，批號：140917006），葡萄糖（Glu，批號：141517008），總膽固醇（T-CHO，批號：141617010），三酰甘油（TG，批號：141717012），肌酸磷酸激酶（CK，批號：142517009），購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;電解質(zhì)分析儀校正液（批號：20190108），購自上海迅達醫(yī)療儀器有限公司;溶血劑（批號：20171021）、稀釋液（批號：111102），購自上海東湖儀器試劑科技有限責任公司，所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.2?儀器?5417R型臺式低溫離心機（德國Eppendorf公司），BS-220型全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），XFA6130型全自動血液細胞分析儀（南京普朗醫(yī)療設備有限公司），XD-685型電解質(zhì)分析儀（上海迅達醫(yī)療儀器有限公司），ASP300型組織脫水機、EG1150H型石蠟包埋機、RM2235型組織切片機、ST4040型半自動染色機、DM4000型電子顯微鏡（德國Leica儀器有限公司）。

1.3 動物 ??SPF級KM小鼠20只，雌性，體質(zhì)量（20±2）g，購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2017-0001，實驗動物質(zhì)量合格證號No.0005059;SPF級SD大鼠80只，雌性，體質(zhì)量（200±20）g，購于重慶市中藥研究院，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2017-0006，實驗動物質(zhì)量合格證號No.?0005115。飼養(yǎng)于西南大學藥學院實驗動物中心，實驗動物使用許可證號SYXK （渝）2014-0002。溫度20～25℃，相對濕度：40%～60%，光照12h/12h明暗交替。

2?方法

2.1?急性毒性試驗[2，4-5]?預試驗中因受藥物濃度及小鼠最大給藥容積的影響，給藥后小鼠未出現(xiàn)死亡，無法計算出香舒丸對小鼠的半數(shù)致死量（LD50） 及最大耐受量，故正式試驗進行最大給藥量試驗。取雌性小鼠20只，隨機分為對照組和給藥組，每組10只。以能通過16號灌胃針的最大濃度7.26g·mL-1、最大灌胃體積0.04mL·g-1給藥，給藥2次，間隔12h，對照組給予等體積蒸餾水，給藥后即刻觀察藥物的毒性反應及死亡情況。連續(xù)觀察14d，記錄小鼠的毒性反應、死亡情況、體重及攝食量，觀察期結(jié)束后，進行血液生化學檢測，肉眼檢查各主要臟器組織病變情況，計算臟器系數(shù)[臟器系數(shù)=臟器重（g）/體重（g）×100%]和最大給藥量。若給藥組的臟器組織的大小、顏色、質(zhì)地與正常臟器有所差異，應進一步進行病理組織學檢查。

2.2?長期毒性試驗[3-6]?取雌性SD大鼠80只，隨機分為對照組、香舒丸11g·kg-1組、22g·kg-1組和44g·kg-1組（分別相當于臨床劑量的30、60、120倍），每組各20只。連續(xù)灌胃給藥13周，每日1次，給藥容積0.01mL·g-1。對照組給予等體積蒸餾水。每日觀察大鼠的一般表現(xiàn)，每周測大鼠體重、攝食量。給藥13周后，每組各隨機取10只大鼠，檢測血液學及血液生化學指標，觀察臟器大體形態(tài)學，稱重、計算臟器系數(shù)，觀察并記錄對照組和香舒丸44g·kg-1組臟器組織病理學變化。余下大鼠停藥正常喂養(yǎng)4周，恢復期結(jié)束后，檢測指標與上述指標相同。

2.3?統(tǒng)計學處理?所得數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計軟件進行分析，以（x±s）表示各指標的平均值和離散程度。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3?結(jié)果

3.1?急性毒性試驗?連續(xù)觀察14d，無小鼠死亡，未出現(xiàn)明顯中毒反應，自主活動、呼吸、飲食、糞便等均未見異常，無脫毛及皮毛顏色改變，眼、口、鼻未見分泌物。與對照組相比，給藥組小鼠體重（如圖1所示）、攝食量（如圖2所示）、血液生化學指標（ALT、AST、ALP、ALB、TP、Glu、Crea、Urea、TG、T-CHO、CK，見表1）、臟器系數(shù)（腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、子宮、卵巢，見表2）差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。肉眼觀察主要臟器（腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、子宮、卵巢、乳腺、胃、小腸、大腸等） 的位置、形狀、大小、色澤、質(zhì)地等均未見明顯異常。由灌胃最大濃度7.26g·mL-1、最大體積0.04mL·g-1，給藥2次，得小鼠的最大給藥量為580.8g·kg-1，該劑量相當于人臨床每日推薦用量的1584倍。

2?長期毒性試驗

2.1?香舒丸對大鼠一般表現(xiàn)的影響?連續(xù)給藥13周及恢復4周，未見大鼠死亡，未出現(xiàn)明顯中毒反應，各組大鼠試驗期間自主活動、呼吸、飲食、糞便未見明顯異常，無脫毛及皮毛顏色改變，鼻、口腔、眼、生殖器等未見異常分泌物。

2.2?香舒丸對大鼠體重和攝食量的影響?各組大鼠體重逐周增加，攝食量變化趨勢相同。連續(xù)給藥13周及恢復4周，與對照組相比，各給藥組大鼠體重、攝食量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。如圖3、4所示。

2.3?香舒丸對大鼠血液學指標的影響?連續(xù)給藥13周及恢復4周，與對照組相比，各給藥組大鼠血液學指標（RBC、HGB、PLT、HCT、MCH、MCV、MCHC、WBC）均差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

2.4?香舒丸對大鼠血液生化學指標的影響 ??連續(xù)給藥13周，與對照組相比，各給藥組血液生化學指標（ALT、AST、ALP、ALB、TG、TP、T-CHO、CK、Glu、K+、Na+、Cl-）差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），其中香舒丸44g·kg-1組Urea顯著升高、Crea顯著降低（P<0.01），且隨著劑量的增加而分別呈上升、下降趨勢，但都在大鼠的正常生理值范圍內(nèi)[4];恢復4周，各給藥組血液生化學指標差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4。

2.5?香舒丸對大鼠大體形態(tài)學的影響?給藥13周及恢復4周，對照組與香舒丸44g·kg-1組受檢臟器及組織（腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、子宮、卵巢、乳腺、胃、小腸、大腸）的位置、形狀、大小、色澤、質(zhì)地等均未見明顯異常。

2.6?香舒丸對大鼠臟器系數(shù)的影響?給藥13周及恢復4周，與對照組相比，各給藥組大鼠的臟器系數(shù)（腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、子宮、卵巢）均無顯著性差異（P>0.05），見表5。

2.7?香舒丸對大鼠臟器組織的影響?給藥13周，香舒丸44g·kg-1組僅1例腎臟輕微礦化，見圖5。對照組與香舒丸44g·kg-1組其他臟器或組織（腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、子宮、卵巢、乳腺）均未發(fā)生明顯病理改變。恢復4周，對照組與香舒丸44g·kg-1組臟器或組織均未發(fā)生明顯病理改變。

3?討論

急性毒性試驗中，由于預試驗受香舒丸濃度及小鼠灌胃體積的限制，無法測出香舒丸對小鼠的半數(shù)致死量（LD50）、最大耐受量（MTD），故采用最大給藥量法進行急性毒性試驗。為了更全面的顯示香舒丸可能存在的急性毒性，除記錄了《中藥、天然藥物急性毒性試驗技術(shù)指導原則》所規(guī)定的一般狀況、體重、攝食量、大體解剖等外，又增加了血液生化學以及臟器系數(shù)的檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，灌胃香舒丸的小鼠的各項指標均無顯著性變化，且最大給藥量為580.8g·kg-1，相當于人臨床每日推薦用量的1584倍，表明香舒丸對小鼠無明顯的急性毒性反應，可供臨床使用[7]。

長期毒性試驗中，給藥13周后，香舒丸44 g·kg-1組大鼠Urea顯著高于對照組、Crea顯著低于對照組，但其數(shù)值均在實驗室大鼠血生化指標正常生理值范圍內(nèi)，且Crea的降低無臨床實際意義，組織病理學檢查中僅1例腎臟出現(xiàn)輕微礦化，其他臟器及組織未出現(xiàn)明顯的病理變化，無統(tǒng)計學及毒理學評價意義，考慮為個別大鼠自發(fā)性病變;恢復4周后該組大鼠Urea、Crea水平與對照組無顯著差異，且各臟器及組織未出現(xiàn)明顯的病理變化。從總體來看，香舒丸各劑量未對給藥期及恢復期大鼠的一般表現(xiàn)、體重、攝食量、血液學指標、血液生化學指標、系統(tǒng)尸檢、臟器系數(shù)及組織病理學等指標產(chǎn)生與藥物毒性相關(guān)的異常變化。提示在本試驗條件下， 香舒丸對大鼠無明顯的蓄積毒性及延遲毒性作用。

香舒丸在臨床上治療肝郁氣滯、血瘀痰凝型乳腺增生具有良好的效果。同期試驗也表明，香舒丸能夠減輕乳腺增生模型大鼠的乳房腫脹、調(diào)節(jié)性激素水平及相關(guān)蛋白的表達、減輕乳腺組織的增生等。本試驗中，香舒丸對雌性小鼠、大鼠均未見明顯的急性毒性及長期毒性反應，表明香舒丸在臨床推薦劑量下服用是較安全的。因此，該處方在臨床上值得進一步臨證推廣應用。同時，將該處方開發(fā)為治療乳腺增生疾病的中成藥制劑也具有極大的必要性。

參考文獻

[1]國家食品藥品監(jiān)督管理總局.藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（總局令第34號） [S]. 2017.

[2] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導原則[S].2014.

[3] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.藥物重復給藥毒性研究技術(shù)指導原則[S].2014.

[4] 陳奇.中藥藥理研究方法學[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社， 2011：121-132.

[5] 魏偉， 吳希美， 李元建.藥理實驗方法學[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社， 2010：393-406.

[6] 袁伯俊， 廖明陽， 李波.藥物毒理學實驗方法與技術(shù)[M].北京：化學工業(yè)出版社， 2007：212-231.

[7] 謝秀瓊， 張世臣.中藥新制劑開發(fā)與應用[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社， 2006：742.

（收稿日期：2019-10-10?編輯：劉斌）