一株野生多孔菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

楊和川 蘇文英 譚一羅 秦裕營(yíng) 馬騰 浦漢春 周振玲

摘要：本研究通過(guò)對(duì)一株野生多孔菌子實(shí)體進(jìn)行分離純化，并對(duì)獲得的菌株進(jìn)行ITS鑒定。序列分析結(jié)果表明，該菌株與硬毛栓菌相似性為100%。進(jìn)一步研究了不同溫度、碳源、氮源以及pH對(duì)野生多孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響，從中選出最優(yōu)的3個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，野生多孔菌菌絲的最適生長(zhǎng)條件為：碳源為蔗糖、氮源為酵母浸粉、pH 7.0、培養(yǎng)溫度為35℃。本研究為野生多孔菌資源的開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：多孔菌;生物學(xué)特性;ITS序列分析

多孔菌（polypore）是高等真菌的一個(gè)類(lèi)群，該類(lèi)群真菌子實(shí)層體呈孔狀、質(zhì)地為革質(zhì)至木質(zhì)[1]。多孔菌廣泛分布于各種類(lèi)型的森林中，目前在我國(guó)已知的多孔菌有704種。多孔菌除了在生態(tài)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的生態(tài)功能外，很多種類(lèi)本身具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如藥用多孔菌靈芝（Ganoderma lucidum）、云芝（Coriolus versicolor）、樺褐孔菌（Inonotus obliquus）、茯苓（Wolfiporia cocos）、桑黃（Inonotus sanghuang）、豬苓（Polyporus umbellatus）等，已被證實(shí)具有調(diào)節(jié)增強(qiáng)人體免疫力、抗腫瘤、降血壓及降血脂等功效[2-5]。有些多孔菌如灰樹(shù)花（Grifola frondosa）、疊生干酪孔菌（ Oligoporus obductus）等，因營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量較高，具有很好的食用價(jià)值[6]。 此外，有些多孔菌產(chǎn)生的木質(zhì)素分解酶，如漆酶（Lacease）、錳過(guò)氧化物酶（Manganese peroxidase）、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Lignin peroxidase），被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、生物修復(fù)、紙漿漂白和環(huán)境治理等領(lǐng)域[7-9]。因此，對(duì)野生多孔菌的采集分離和應(yīng)用研究，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景。本研究將利用從連云港市海州區(qū)許莊村采集的野生多孔菌子實(shí)體為試材，分離獲得其菌絲體并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性和分子鑒定研究，為保護(hù)野生多孔菌生物多樣性及資源的合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試菌株野生多孔菌采自江蘇省連云港市海州區(qū)許莊村，供試菌株為野生分離。保藏于連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)中心，編號(hào)DK1。轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上活化，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2供試固體培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨3g，瓊脂20g，水1L，pH自然。碳源實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：碳源 20g、蛋白胨3g，瓊脂20g，水1L，pH自然。氮源實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：氮源3g、葡萄糖20g，瓊脂20g，水1L，pH自然。pH 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨3g，瓊脂20g，水1L，調(diào)節(jié)pH。溫度實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨3g，瓊脂20g，水1L，pH自然。

1.2方法

1.2.1菌種活化在超凈工作臺(tái)上將保存的野生多孔菌菌株轉(zhuǎn)接至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)。

1.2.2ITS序列分析菌絲體總DNA提取利用DNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京）。以真菌通用引物ITS1（ 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'） 和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGGATATGC-3'）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系采用50 μL體系（10×Taq Buffer，3μ;dNTP，4μ;ITS1，2μ;ITS4，2μ;DNA Taq 聚合酶，1μ;基因組DNA，3μ;ddH2O，33μ），反應(yīng)條件為：94℃，2min;94℃，30s;56℃，30s;72℃，30s; 30 次循環(huán)，72℃，10min。獲得的PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。引物合成與PCR產(chǎn)物測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。測(cè)得的 ITS 序列通過(guò) BLAST 軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3碳源試驗(yàn)分別以等量麥芽糖、淀粉、蔗糖、乳糖替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，121℃滅菌20min后倒入9cm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿裝培養(yǎng)基15mL，待培養(yǎng)基凝固后，用打孔器（ 直徑8 mm） 在菌種菌落邊緣取接種塊分別接種，每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)，接種后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。自接種后48h 開(kāi)始，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，觀(guān)察并記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)。

1.2.4氮源試驗(yàn)分別以等量硫酸銨、酵母浸粉、氯化銨、尿素替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蛋白胨，實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2。

1.2.5溫度試驗(yàn)將接種后的平板培養(yǎng)皿分別置于 15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃不同溫度條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù) （培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基 ） ，實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2。

1.2.6pH試驗(yàn)用0.?5047mol /L 的鹽酸和 0.?5001 mol /L 氫氧化鈉溶液分別調(diào)各培養(yǎng)基初始pH為5.0、6.?0、7.0、8.?0、9.0，實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2。

1.2.7正交試驗(yàn)在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取各單因素實(shí)驗(yàn)中中最優(yōu)良的3個(gè)條件進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2。

2結(jié)果與分析

2.1ITS序列分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，獲得供試菌株ITS序列片段，經(jīng)Blast在線(xiàn)比對(duì)后，與相近種菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，供試菌株DK1與硬毛栓菌（Trametes trogii）（EU790491.1）的相似性最高，達(dá)到100%。

2.2不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)菌株在不同碳源下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1。以葡萄糖和麥芽糖為碳源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度較快，菌落邊緣整齊，但菌絲較為稀疏，其次為蔗糖，乳糖，可溶性淀粉為碳源時(shí)菌絲生長(zhǎng)最為緩慢。

2.3不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)菌株在不同氮源下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2。以酵母浸粉為氮源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度較快，菌落邊緣整齊，且菌絲濃密，其次為蛋白胨，氯化銨以及硫酸銨為氮源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度相差不大，但菌絲較為稀疏。在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上，實(shí)驗(yàn)菌株菌絲未見(jiàn)萌發(fā)。

2.4不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

野生多孔菌菌株在不同溫度下菌絲的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)菌株在15～45℃溫度范圍內(nèi)均能萌發(fā)生長(zhǎng)，但在15℃條件下培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)菌株菌絲生長(zhǎng)速度明顯慢于其他溫度條件下培養(yǎng)菌絲。從菌絲長(zhǎng)勢(shì)及生長(zhǎng)速度來(lái)看，35℃更利于實(shí)驗(yàn)菌株菌絲的生長(zhǎng)。

2.5不同pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)菌株在不同pH下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2。菌絲在pH 6～9.0的條件下均可生長(zhǎng)，且多孔菌菌絲在不同pH下差異并不顯著。綜合比較，最適pH為7.0。

2.6正交實(shí)驗(yàn)

對(duì)碳源、氮源、pH 和溫度4個(gè)因素進(jìn)行篩選，挑選出最優(yōu)3 組水平處理，選擇4因素3水平作L9（34）正交試驗(yàn)（表5）。結(jié)果顯示，4種因素對(duì)多孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響為：溫度>氮源>pH>碳源。綜合評(píng)價(jià)，野生多孔菌最佳生長(zhǎng)條件是蔗糖、酵母浸粉、pH 7.0、35℃。

3小結(jié)

硬毛栓菌（Trametes trogii）是一種廣分分布于世界各地的白腐擔(dān)子菌，目前的多項(xiàng)研究都已證實(shí)該菌可被用于工業(yè)染料的脫色[11]。在本研究中，通過(guò)ITS分子生物學(xué)鑒定，野生多孔菌菌株DK1與硬毛栓菌相似性最高，為100%。但該菌株是否為硬毛栓菌，還需進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)鑒定。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)以及正交實(shí)驗(yàn)，最終確定野生多孔菌的最適生長(zhǎng)條件為：碳源為蔗糖、氮源為酵母浸粉、pH 7.0、培養(yǎng)溫度為35℃。本研究為野生多孔菌菌株的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]周麗偉， 戴玉成. 中國(guó)多孔菌多樣性初探： 物種， 區(qū)系和生態(tài)功能[J]. 生物多樣性， 2013， 21（4）： 499-506.

[2] 林志彬. 靈芝抗腫瘤作用的免疫學(xué)機(jī)制及其臨床應(yīng)用[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2015（29）： 865-882.

[3] Wu MD， Cheng MJ， Wang WY， et al. Antioxidant activities of extracts and metabolites isolated from the fungus Antrodia cinnamomea[J]. Natural Product Research， 2011（25）： 1488-1496.

[4] Wang Q， Mu H， Zhang L， Dong D， Zhang W， Duan J. Characterization of two water-soluble lignin metabolites with antiproliferative activities from Inonotus obliquus [J]. Intern J Biol Macromolecules， 2015（74）： 507-514.

[5] Soccol C R， Bissoqui L Y， Rodrigues C， et al. Pharmacological properties of biocompounds from spores of the lingzhi or reishi medicinal mushroom ganoderma lucidum （Agaricomycetes）： A Review[J]. International journal of medicinal mushrooms， 2016， 18（9）：757-767.

[6] Zhou L W， Yang Z L， Wen H A， et al. A revised checklist of edible fungi in China[J]. Mycosystema， 2010， 29（1）： 1-21.

[7] 潘忠成， 賴(lài)娜， 李琛，等. 白腐菌在廢水處理中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 化工技術(shù)與開(kāi)發(fā)， 2013（7）：59-63.

[8] Pezzella C， Guarino L， Piscitelli A. How to enjoy laccases[J]. Cellular & Molecular Life Sciences， 2015， 72（5）：923-940.

[9] 田野， 劉鵬， 楊秀麗. 紙漿生物漂白的研究進(jìn)展[J]. 江蘇造紙， 2010， 41（4）：27-32.

[10]Younes S B， Cherif I， Dhouib A， et al. Trametes trogii ： A Biologic Powerful Tool for Dyes Decolorization and Detoxification[J]. Catalysis Letters， 2016， 146（1）：1-8.