冷藏鱘魚片優(yōu)勢腐敗菌的分離與鑒定

李小義 才讓卓瑪 楊星 吳丹 楊明舉

摘要：為確定鱘魚片低溫冷藏過程中優(yōu)勢腐敗菌，將鱘魚片包裝后在低溫（4±0.5）℃條件下貯藏，12 d后利用選擇性培養(yǎng)基進行腐敗菌的分離篩選。通過生理生化、形態(tài)學(xué)鑒定及16S rDNA序列分析，對低溫貯藏過程中鱘魚片的優(yōu)勢腐敗菌進行鑒定。結(jié)果表明：鱘魚片在低溫條件下貯藏至12 d時的優(yōu)勢腐敗菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas， 56.25%）、肉食桿菌屬（Carnobacterium，12.5%）、哈夫尼菌屬（Hafnia，12.5%）、漫游球菌屬（Vagococcus，6.25%）、庫特氏菌屬（Kurthia，6.25%）、普羅維登斯菌屬（Providencia，6.25%）等。

關(guān)鍵詞：鱘魚片;冷藏;腐敗微生物;分離;鑒定

由于營養(yǎng)學(xué)家們對減少飽和脂肪攝入的提倡，富含多不飽和脂肪酸肉類的消費量大幅增加，然而，多不飽和會加速氧化過程，導(dǎo)致肉的味道、顏色、質(zhì)地和營養(yǎng)價值的惡化[1]。淡水魚類因其組織結(jié)構(gòu)疏松、蛋白質(zhì)含量高、脂肪高度不飽和等特點，在加工、運輸及貯藏等過程中受到微生物的污染后，其肉質(zhì)容易被氧化，引起魚體腐敗變質(zhì)，貨架期縮短，逐漸失去營養(yǎng)價值和商品價值[2-3]。微生物是引發(fā)魚體腐敗變質(zhì)的主要原因。近年來，人們對導(dǎo)致魚體腐敗的微生物進行了較多的研究。高白鮭魚片冷凍和冰鮮保藏初期腐敗菌主要為假單胞菌，隨著保藏時間延長，腸桿菌逐漸成為優(yōu)勢腐敗菌[4]。李秀秀等人對鯽魚貯藏過程中優(yōu)勢腐敗菌研究發(fā)現(xiàn)：導(dǎo)致魚肉腐敗的優(yōu)勢微生物為熒光假單胞菌，與導(dǎo)致魚鰓腐敗的優(yōu)勢微生物存在差異[5]。

鱘魚為高蛋白、多脂肪性魚類，是世界上優(yōu)良的淡水魚品種，也是現(xiàn)存于世界上最珍奇、最古老的冷水性生物魚群之一，有“活化石”之稱，其肉厚骨軟，含有人體必需的多種氨基酸，具有很高的經(jīng)濟價值和藥用價值。目前對鱘魚及鱘魚加工產(chǎn)品腐敗菌群和保鮮技術(shù)研究較少，阻礙了鱘魚鮮活及加工產(chǎn)品的市場貿(mào)易。本文對冷藏過程中鱘魚片腐敗微生物進行了分離鑒定，旨在提高人們對鱘魚冷藏過程腐敗微生物的認(rèn)識和為鱘魚片保鮮劑的研究制備提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

本研究所用鱘魚采至貴州省水產(chǎn)研究所惠水養(yǎng)殖基地。

1.2主要儀器和試劑

離心機，德國Eppendorf 公司; 電泳儀，北京市六一儀器廠;Gel-Doc2000凝膠成像分析儀，美國BIO-RAD公司;PCR 儀，美國BIO-RAD 公司。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302），天根生化科技（北京）有限公司;DNA Marker，上海生工生物工程股份有限;革蘭氏染液、微生物生理生化微量鑒定管、鐵瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、假單胞培養(yǎng)基、Baird-Parker Ager、MYP甘露醇多粘菌素瓊脂培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、察氏瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司; 藥敏試紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3鱘魚片的制備與保藏

從貴州省水產(chǎn)研究所惠水養(yǎng)殖基地采集1500g左右的鮮活鱘魚3條，首先將鱘魚體表粘液清洗干凈，沿腹部剖剪開，去除內(nèi)臟和魚頭，隨后用清水清洗干凈，去除魚骨，剝?nèi)ヴ~皮。對獲得的鱘魚肉用無菌水沖洗數(shù)分鐘，洗凈瀝干切片后將鱘魚片置于保鮮盒中，放入冰箱4±0.5℃保藏12d。取腐敗變質(zhì)的鱘魚片進行腐敗微生物的分離鑒定。

1.4可培養(yǎng)菌株的分離純化

無菌條件下取腐敗變質(zhì)的鱘魚片10g于50mL無菌離心管內(nèi)，使用手持式勻質(zhì)器將鱘魚片制成勻漿狀，隨后在試管內(nèi)加入20mL無菌水，置于震蕩器上震蕩5min。取1mL 上清液，梯度稀釋至10-8，每個稀釋度做3個重復(fù)。分別取200 μL稀釋液于不同的選擇分離培養(yǎng)基內(nèi)，采用平板涂布法涂板培養(yǎng)。不同培養(yǎng)基分離培養(yǎng)溫度和時間如表1所示。待培養(yǎng)基上菌落生長以后，從平板上挑取典型生長菌落。以LB瓊脂培養(yǎng)基為純化培養(yǎng)基，分離純化3次，獲得單菌落，用于菌種的初步鑒定。

1.5菌株生理生化試驗

參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]對分離純化獲得的單菌進行生理生化鑒定。

1.6單菌16S rRNA基因分析

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對分離獲得的單菌DNA進行抽提，操作方法參考試劑盒說明書。

16S rRNA基因測序及系統(tǒng)發(fā)育分析：16S rRNA基因正向擴增引物： 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（ 位于E.coli 16S rRNA基因的第8～27個堿基位置） ; 反向擴增引物：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3'（ 位于E.coli 16S rRNA基因的第1512～1493個堿基位置）[7]。PCR擴增條件：95℃預(yù)變性5min;接著94℃變性1min，55℃復(fù)性1min，72℃延伸1.5min，32 個循環(huán);最后72℃溫育10min。 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖（ 質(zhì)量占比） 凝膠電泳確定條帶后直接交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。

2結(jié)果與分析

2.1可培養(yǎng)優(yōu)勢菌的分離純化

從不同成分的選擇培養(yǎng)基上挑取優(yōu)勢菌株進行純化，剔除重復(fù)共獲得16株單菌。以下實驗均以這16株菌為材料。

2.2單菌生理生化鑒定

16株單菌的生理生化檢測結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，16株菌株均不能利用葡萄糖進行產(chǎn)氣，不能產(chǎn)硫化氫，同時也不能利用側(cè)金盞花醇。

2.316S rDNA基因分析

對分離的菌株進行16S rDNA基因擴增、測序和Blastn比對分析，16株單菌的16S rDNA序列相似性與模式菌株序列相似性在99.75%～100%之間。16株單菌的系統(tǒng)進化分析結(jié)果如圖1所示。分離的16株單菌主要分布在γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和芽胞桿菌綱（Bacilli），分別占比75%和25%，分屬于假單胞菌屬（Pseudomonas， 56.25%）、肉食桿菌屬（Carnobacterium，12.5%）、哈夫尼菌屬（Hafnia，12.5%）、漫游球菌屬（Vagococcus，6.25%）、庫特氏菌屬（Kurthia，6.25%）、普羅維登斯菌屬（Providencia，6.25%）等6個屬。16株菌的16S rDNA系統(tǒng)進化樹如圖1所示。

3討論

魚體種類、來源及貯藏方式不同，優(yōu)勢腐敗菌組成復(fù)雜且變化大。冬、春時期中冷藏鯧魚貯藏期間優(yōu)勢腐敗菌的種類基本一致，以革蘭氏陰性菌為主，主要腐敗菌為嗜冷桿菌、草莓假單胞菌、熒光假單胞菌、熱殺索絲菌及腐敗希瓦氏菌等[8]。在鱸魚-2℃微凍和4℃冷藏情況下H2S菌和假單胞菌增長快，主要優(yōu)勢腐敗菌為腐敗希瓦氏菌和假單胞菌。鯧魚在氣調(diào)包裝冷藏期間，腐敗希瓦氏菌、熒光假單胞菌與嗜冷桿菌為主要優(yōu)勢菌[9]。添加0.2%山梨酸和苯甲酸等改變水產(chǎn)品pH值對酵母、霉菌和許多真菌具有抑制作用，但可使乳酸菌變?yōu)閮?yōu)勢菌[10]。真空包裝冷藏條件下，鱘魚的優(yōu)勢腐敗菌為氣單胞菌和腸科菌[11]。蘿卜籽蛋白提取物處理鱘魚片后，托盤包裝貯藏可有效減少腐敗微生物的生長[12]。

唐文靜等人對海鱸魚冷藏期間的腐敗菌進行分離鑒定，獲得4株優(yōu)勢腐敗菌，其中草莓假單胞菌具有較強的致腐能力[13]。劉愛芳等人研究了假單胞菌、不動桿菌及熱死環(huán)絲菌對金槍魚的致腐能力，結(jié)果表明假單胞菌致腐能力較強[14]。庫特氏菌最初從雞腸道分離獲得，未有研究顯示該菌屬與肉類的腐敗變質(zhì)直接相關(guān)，但卻是豆腐腐敗的特定腐敗菌[15-16]。乳酸菌廣泛存在于自然界，且物種多樣性豐富，其多個屬被鑒定為引起食品腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢腐敗菌，肉食桿菌屬是水產(chǎn)品中常見的乳酸菌[17]。肉食桿菌屬[JP]（Carnobacterium maltaromaticum）為小黃魚在真空和氣調(diào)包裝冷藏條件下的優(yōu)勢腐敗菌[18]。蜂房哈夫尼菌易引起真空包裝的肉制品腐敗變質(zhì)[19]。本研究通過對低溫冷藏12d的鱘魚片腐敗微生物進行分離鑒定，共獲得16株單菌，主要分布在假單胞菌屬、庫特氏菌屬、肉食桿菌屬、哈夫尼菌屬、普羅維登斯菌屬及漫游球菌屬等。其中，假單胞菌為主要優(yōu)勢菌屬。本文分離獲得的菌屬對鱘魚片的致腐能力還有待進一步研究。

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