棉花導(dǎo)入系耐鹽性鑒定及耐鹽基因QTL定位

朱協(xié)飛，司占峰

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210095）

我國鹽堿地面積達(dá)2.7×107hm2，鹽脅迫已成為限制土地生產(chǎn)力的主要因素之一[1]。隨著耕地面積的減少，棉花種植區(qū)域逐漸向鹽堿地集中，選用耐鹽品種是提高鹽堿棉田棉花產(chǎn)量的重要措施[2]。棉花是鹽堿地種植的先鋒作物[3]。棉籽在較高NaCl濃度下仍然能發(fā)芽[4]，但一般來講，當(dāng)土壤含鹽量0.2%～0.3%時(shí)出苗困難，0.4%～0.5%時(shí)種子不能出土，大于0.65%時(shí)很難發(fā)芽[5]。NaCl主要影響種子吸水膨脹，造成萌發(fā)慢，萌發(fā)率低，鹽濃度越大，這種滲透脅迫越嚴(yán)重。出苗后，棉花從異養(yǎng)向自養(yǎng)過渡，此時(shí)鹽分脅迫引起幼苗畸形，子葉難展平，嚴(yán)重時(shí)葉綠素合成受阻、棉苗黃化。二、三葉期的棉苗體內(nèi)已開始花芽分化，此時(shí)對(duì)鹽分最為敏感。鹽脅迫下，棉花葉片發(fā)軟、色暗、功能期短，脫落早，側(cè)根發(fā)生少、發(fā)生區(qū)黃褐色，干物質(zhì)積累減少，生長停滯，甚至死苗。隨著鹽脅迫時(shí)間加長或強(qiáng)度加大，幼苗株高、葉面積、綠葉數(shù)、側(cè)根數(shù)等指標(biāo)的減少量也越大。從干物質(zhì)積累的根冠比來看，大多引起根冠比變大[6]，說明棉苗地上部所受傷害更大。劉國強(qiáng)等[7]對(duì)棉花4個(gè)栽培種4 078份品種資源的耐鹽性進(jìn)行苗期鑒定表明，栽培種之間的耐鹽性差異很大，并且棉花的總體耐鹽性較差。李函利等[8]對(duì)179份來源不同的低酚棉種質(zhì)資源的耐鹽性進(jìn)行鑒定，沒有發(fā)現(xiàn)高抗材料，抗鹽材料占鑒定材料的2.2%、耐鹽材料占30.2%、鹽敏感材料占67.6%等。在棉花種質(zhì)資源的耐鹽性鑒定指標(biāo)方面，葉武威等[9]采用芽長和芽質(zhì)量作為耐鹽鑒定指標(biāo)，孫小芳等[10]采用相對(duì)出苗率、苗期對(duì)株高、相對(duì)葉面積作為耐鹽鑒定指標(biāo)，沈法富等[11]采用棉花葉片總面積和葉片鮮物質(zhì)質(zhì)量減少的分?jǐn)?shù)作為耐鹽鑒定指標(biāo)。本研究采用NaCl處理后植株鮮物質(zhì)質(zhì)量增加量的變化為鑒定指標(biāo)，以檢測(cè)各個(gè)導(dǎo)入系材料對(duì)NaCl處理的反應(yīng)。

近年來，人們利用回交，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，構(gòu)建了大規(guī)模染色體片段導(dǎo)入系（Chromosomal segment introgression lines，CSIL），并且在水稻、玉米、小麥、棉花等作物育種實(shí)踐中取得了重要進(jìn)展[12-24]。但對(duì)染色體片段導(dǎo)入系耐鹽性狀的遺傳研究報(bào)道很少。王鵬等[20-21]利用陸地棉TM-1與海島棉7124為親本培育了海島棉染色體片段導(dǎo)入系，該套導(dǎo)入系共有174個(gè)家系，包含298個(gè)染色體片段，導(dǎo)入片段總長度2 329.2 cM，覆蓋長度1 433.6 cM，覆蓋了棉花基因組81.3%。利用該導(dǎo)入系精細(xì)定位了與品質(zhì)性狀、產(chǎn)量性狀相關(guān)的QTLs（Quantitative trait loci），為染色體片段導(dǎo)入系在育種中的應(yīng)奠定了基礎(chǔ)[21]。本文選取了王鵬等[20-21]培育的海島棉染色體片段導(dǎo)入系的148個(gè)家系進(jìn)行耐鹽性鑒定，并對(duì)耐鹽相關(guān)QTL進(jìn)行定位，以期明確這類導(dǎo)入系種質(zhì)資源的耐鹽性水平，篩選耐鹽性好的種質(zhì)資源，為耐鹽育種和耐鹽基礎(chǔ)研究提供重要的資源材料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為本課題組利用海島棉7124（提供染色體片段）與陸地棉TM-1培育的148份染色體片段導(dǎo)入系，分別命名為CSIL001～CSIL148。以導(dǎo)入系供體親本海島棉7124與輪回親本陸地棉TM-1作為對(duì)照品種（表1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1材料種植與試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)于2016年5～6月在安徽省當(dāng)涂縣南京農(nóng)業(yè)大學(xué)皖江基地進(jìn)行。經(jīng)硫酸脫絨后，每份材料中各挑選72粒飽滿一致的種子，采用穴盤育苗方式播種。穴盤規(guī)格：12孔/行×6行，育苗塞高度7 cm，播種面4 cm×4 cm。每穴盤播種2個(gè)材料，每個(gè)材料播種3行，設(shè)為3個(gè)重復(fù)，留苗36株，處理前后選擇27株較均勻一致的苗分別稱取質(zhì)量統(tǒng)計(jì)。

棉花耐鹽性鑒定采用NaCl脅迫法[3]。因此本研究以NaCl處理來檢測(cè)導(dǎo)入系耐鹽性，并計(jì)算鹽害系數(shù)。

試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理。處理1：5月10日播種，6月1日稱鮮物質(zhì)質(zhì)量。處理2：5月10日播種，6月1日托盤中加水2.2升（加滿整個(gè)托盤），6月10日稱鮮物質(zhì)質(zhì)量。處理3：5月10日播種，6月1日托盤中加入與處理2等量的25 g·L－1NaCl溶液，6月10日稱取鮮物質(zhì)質(zhì)量。

1.2.2鹽處理與鹽害統(tǒng)計(jì)方法。鹽濃度確定：在多次試驗(yàn)基礎(chǔ)上，將NaCl質(zhì)量濃度確定為25 g·L－1。

鹽害系數(shù)計(jì)算參照張國偉的方法[2]。即：鹽害系數(shù)＝（對(duì)照值－處理值）/對(duì)照值×100%。本試驗(yàn)對(duì)照值、處理值分別采用相對(duì)生長量值。即：對(duì)照值＝處理2－處理1，處理值＝處理3－處理1。

1.2.3QTL定位方法。結(jié)合已有導(dǎo)入系的分子鑒定數(shù)據(jù)[21]，利用QTL IciMapping 4.0軟件進(jìn)行耐鹽性狀QTL定位，以LOD≥2.5作為閾值分別來判斷具有加性效應(yīng)的QTL是否存在，并分析其特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 148個(gè)導(dǎo)入系及2個(gè)親本3個(gè)處理的植株鮮物質(zhì)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)及鹽害系數(shù)計(jì)算

6月10日觀察，與處理2相比，處理3多數(shù)材料表現(xiàn)出明顯的鹽害癥狀（圖1）。

表1列出了148個(gè)導(dǎo)入系及2個(gè)親本3個(gè)處理的植株鮮物質(zhì)質(zhì)量及鹽害系數(shù)。由于部分材料高度感鹽，處理3鹽脅迫10 d后，其鮮物質(zhì)質(zhì)量反而低于處理1，導(dǎo)致鹽害系數(shù)大于100%，表中均以100%列出。從表1可以看出，供體親本海7124、受體親本TM-1的鹽害系數(shù)分別為29.35 %、71.70%。148個(gè)導(dǎo)入系的耐鹽性差異較大，鹽害系數(shù)為1.34%～100%，平均鹽害系數(shù)為61.22%，介于兩個(gè)親本之間，表明導(dǎo)入的染色體片段長度及位置差異會(huì)導(dǎo)致導(dǎo)入系的耐鹽性差異，甚至?xí)档蛯?dǎo)入系的耐鹽水平。

表1 導(dǎo)入系鮮物質(zhì)質(zhì)量及鹽害系數(shù)Table 1 Fresh weight of Introgression lines and their salt damage coefficients

表1 （續(xù)）Table 1(continued)

圖1 部分材料生長情況比較Fig.1 Seedlings comparison under different treatments

以兩個(gè)親本的鹽害系數(shù)為界線，把148個(gè)導(dǎo)入系的鹽害系數(shù)分成3組，鹽害系數(shù)在0～29.35%的導(dǎo)入系有35個(gè)，占23.65%；鹽害系數(shù)29.35%～71.70%的有58個(gè)，占39.19%；鹽害系數(shù)71.70%～100%的有55個(gè)，占37.16%。表明有37.16%的導(dǎo)入系耐鹽性降低，但62.82%的導(dǎo)入系耐鹽性有所提高，23.65%的導(dǎo)入系耐鹽性優(yōu)于兩個(gè)親本。說明從陸地棉背景的海島棉染色體片段導(dǎo)入系中進(jìn)行耐鹽材料篩選是可行的。

2.2 導(dǎo)入系耐鹽性狀的QTL定位

利 用QTL IciMapping 4.0（http://www.isbreeding.net）檢測(cè)CSIL群體中耐鹽性狀QTL所產(chǎn)生的加性效應(yīng)，以LOD≥2.5作為閾值分別來判斷具有加性效應(yīng)的QTL是否存在，結(jié)果見表2。

共檢測(cè)到23個(gè)耐鹽相關(guān)的QTLs，分布在9條染色體上，其中11個(gè)QTL加性效應(yīng)表現(xiàn)為正值，貢獻(xiàn)率在1.18%～2.29%之間，表明NaCl處理嚴(yán)重影響了植株的生長；12個(gè)QTL加性效應(yīng)表現(xiàn)為負(fù)值，貢獻(xiàn)率在1.11%～3.18%之間，表明NaCl處理對(duì)其影響較小，對(duì)應(yīng)的染色體片段含有耐NaCl基因，可在改良棉花抗鹽性上加以利用。我們還發(fā)現(xiàn)，耐鹽相關(guān)QTLs呈現(xiàn)染色體聚集分布，其中A02、A03、D01、D02和D07上都至少有2個(gè)不耐鹽的QTL，而A05、A12、D05和D11上都至少有2個(gè)耐鹽的QTL，其他染色體未檢測(cè)出耐鹽相關(guān)的QTL。尤其是A5和D5兩條染色體共檢測(cè)出7個(gè)耐鹽相關(guān)QTL，因此在抗逆育種中針對(duì)特定染色體的選擇能大大提高選擇效率。

表2 耐鹽性狀QTL定位Table 2 Mapping of QTLs for salt tolerance-related traits

3 討論

一般認(rèn)為，棉花幼苗苗齡小，苗體嫩，但體內(nèi)已開始花芽分化，對(duì)鹽分脅迫比較敏感，極易遭受土壤中鹽分毒害而導(dǎo)致生育緩慢甚至死苗[7,25]。因此在棉花耐鹽性鑒定時(shí)，鹽濃度的高低將對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生重要影響，甚至決定試驗(yàn)成敗。Levittd等認(rèn)為棉花生長的極限鹽度為0.6%～0.7%[26]。由于試驗(yàn)方法不同，本研究參考前人研究成果，并在多次試驗(yàn)基礎(chǔ)上，將鹽質(zhì)量濃度確定為25 g·L－1，試驗(yàn)結(jié)果良好。

對(duì)于棉花耐鹽性鑒定方法，前人多采用雙層濾紙法研究棉花萌發(fā)出苗期的耐鹽性[27-28]，但棉花種子上帶有一定的真菌，這些真菌在濾紙上容易感染，增加了試驗(yàn)誤差。本試驗(yàn)采用穴盤育苗方式播種，與大田生產(chǎn)育苗方法一致。對(duì)苗期植株相對(duì)生長量進(jìn)行耐鹽性鑒定，方法簡(jiǎn)單、直觀，實(shí)際操作更接近大田生產(chǎn)。

目前耐鹽性狀的QTL定位已普遍用于水稻、玉米等作物的分子育種研究[29-31]，在棉花中研究報(bào)道較少。郭紀(jì)坤[32]利用（魯棉97-8×蘇12）F2分離群體，檢測(cè)到4個(gè)與抗鹽相關(guān)的QTL位點(diǎn)，貢獻(xiàn)率為5.47%～17.20%。George Oluoch[33]利用陸地棉品種中棉所12和野生棉毛棉的種間雜交F2:3家系進(jìn)行耐鹽性QTL定位，共有11個(gè)QTL在至少兩個(gè)環(huán)境中被定位到，分布于8條染色體（A09、A11、D01、D07、D08、D09、D11和D12染色體），在兩種環(huán)境下單個(gè)位點(diǎn)分別解釋了11.97%和18.44%的表型變異，其中D11染色體檢測(cè)到的位點(diǎn)與本研究中檢測(cè)到的位于相近的位置。將陸地棉背景的海島棉染色體片斷導(dǎo)入系作為研究對(duì)象進(jìn)行耐鹽性狀的QTL定位未見報(bào)道，因此，本研究在棉花耐鹽基因資源挖掘有一定的創(chuàng)新意義。

4 結(jié)論

本研究以148份陸地棉背景的海島棉染色體片斷導(dǎo)入系為研究對(duì)象，利用苗期植株相對(duì)生長量進(jìn)行耐鹽性鑒定，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入系耐鹽性差異較大，總體耐鹽水平較高，有35個(gè)材料的鹽害系數(shù)在0～29.35%之間。進(jìn)一步進(jìn)行耐鹽性狀的QTL定位，檢測(cè)到了23個(gè)鹽害相關(guān)的QTL，其中12個(gè)抗鹽QTL，聚集分布在A05、A12、D05和D11染色體上，有一個(gè)QTL與前人研究檢測(cè)到的QTL位于相近的位置。因此，這些導(dǎo)入系中的部分材料可以作為耐鹽資源，進(jìn)行耐鹽育種及相關(guān)研究，對(duì)特定染色體的篩選會(huì)具有更高的效率。