血型嵌合體一例血清學特點及基因?qū)W測序分析

孔存權(quán)，連利霞，朱偉彥，楊子怡，燕備戰(zhàn)

河南省人民醫(yī)院(鄭州大學人民醫(yī)院)輸血科 鄭州 450003

嵌合體指其細胞衍生自兩個或多個受精卵的個體，遺傳學上指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現(xiàn)的個體，免疫學上則指一個機體有兩種或兩種以上染色體組成不同的細胞系彼此耐受不排斥的嵌合狀態(tài)。血型嵌合體是嵌合體的一種，又叫血型開米拉，多發(fā)生在異型輸血、異卵雙生或雙精受精以及異型骨髓移植后，其中異型輸血或異型骨髓移植后的血型嵌合屬于暫時性嵌合，而遺傳性嵌合屬于永久性嵌合(先天性嵌合)。嵌合體尤其是血型嵌合體的存在往往給臨床輸血工作帶來一些問題，諸如血型鑒定困難、輸血困難、親緣關(guān)系疑問等。早期，血型嵌合體的檢測局限于血清學方法，表現(xiàn)為混合凝集外觀，但很難確診。分子生物學技術(shù)，尤其是PCR體外擴增和DNA測序技術(shù)的發(fā)展，為血型嵌合體的研究提供了工具。本研究借助一例嵌合體血型患者，回顧分析了血型嵌合體的血清學及基因?qū)W特點。

1 材料與方法

1.1標本來源該例為河南省人民醫(yī)院門診患者，年齡、疾病不詳，無輸血史，無移植史。

1.2試劑及儀器單克隆抗A、抗A1、抗B、抗AB、抗H抗體及標準反定型紅細胞A細胞(Ac)、B細胞(Bc)和O細胞(Oc)均購于長春博德公司。DNA提取試劑盒購自上海生工生物技術(shù)有限公司。血型正反定型卡與抗人球蛋白卡購自戴安娜公司。引物合成及測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.3血清學試驗采用試管法與戴安娜血型定型凝膠卡進行ABO正反定型，正定型增加抗A1、抗H以及自身對照，反定型增加Oc。用多特異性抗人球蛋白卡(IgG與C3)檢測紅細胞上有無不完全抗體，用抗篩細胞檢測血清中有無不規(guī)則抗體。采用吸收放散技術(shù)檢測弱B抗原。

1.4基因?qū)W定型用血液DNA抽提試劑盒抽提先證者及其父親、母親、兒子外周血基因組DNA，分別對ABO基因的外顯子1～7進行PCR擴增，引物序列和擴增條件參考文獻[1]。PCR體系(25 μL)中包含基因組DNA、引物、混合La酶，反應(yīng)在美國ABI ProFlex PCR System儀上進行。反應(yīng)條件為95 ℃3 min，95 ℃30 s、57 ℃30 s、72 ℃60 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。其中第1外顯子GC含量高，需要GC buffer，各成分加入量及反應(yīng)條件略有變動。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物2 μL用于瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，獲取目的條帶后，取10 μL進行測序分析。分別對先證者及其父母ABO 基因的7個外顯子及其側(cè)翼序列直接測序。同時將先證者血型基因第7外顯子的PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體(TaKaRa公司)，在ABI377測序儀上對插入片段進行序列分析。

1.5交叉配血試驗基于疑似嵌合體血型和血清學結(jié)果，擬用配合性輸注(O型洗滌紅細胞)，采用凝聚胺結(jié)合卡氏法(Liss-coombs卡)進行交叉配血試驗。

2 結(jié)果

2.1血清學結(jié)果先證者紅細胞定型：抗A與抗D凝集強度均為4+、抗B抗血清呈混合凝集(±)且抗B測定管(或抗人球蛋白卡)底部有大量紅細胞，未檢出抗A1，反定型Ac、Bc、Oc均不凝集(表1)。家系調(diào)查結(jié)果顯示其父為B型、RhD+，母為A型、RhD+，兒為O型、RhD+，正反定型均一致。先證者B抗體管內(nèi)底層經(jīng)洗滌后的紅細胞與B抗體血清不凝集，與A抗體凝集，提示是A型紅細胞，說明該患者血里既有A型紅細胞又有B型紅細胞。先證者直接抗球蛋白試驗陰性，不規(guī)則抗體篩查試驗陰性，吸收放散試驗證實存在B抗原。

表1 先證者及家系調(diào)查血清學結(jié)果

0代表無凝集，+代表凝集強度，±代表混合凝集

2.2基因檢測結(jié)果先證者第6、7外顯子區(qū)域顯示存在261G/del、297A/G、467C/T、526C/G、646T/A、657G/T、681G/A、703G/A、771C/T、796C、803G/C、829G/A、930G/C等雜合位點(圖1)，初步判斷可能有3個等位基因：A102、B101和O02。測序結(jié)果表明先證者含有A102、B101與O02等3個等位基因。家系調(diào)查結(jié)果顯示其父基因型為B101O02，母為A102O01，子為O01O02，姐為B101O02。

A，B：雜合位點位于血型基因第6外顯子；C、D、E、F：雜合位點位于血型基因第7外顯子

2.3交叉配血AB型懸浮紅細胞配血主、次側(cè)均無溶血、無凝集。A、B、O型懸浮紅細胞配血主側(cè)均無溶血、無凝集，次側(cè)均無溶血、有凝集。

3 討論

先證者表現(xiàn)出兩群不同表型的紅細胞，應(yīng)該屬于遺傳性血型嵌合體。這種在體內(nèi)存在兩種不同遺傳學特征細胞群的天然個體極為罕見，通常在兩個受精卵合二為一融合時或胞胎之間血管未分開時已經(jīng)發(fā)生。鑲嵌現(xiàn)象(發(fā)生自單個配子)和嵌合體(發(fā)生自兩個或多個配子)等[2]也屬于這類情況。血型嵌合體還會導(dǎo)致ABO表現(xiàn)型與基因型不相符[3]，如在中國臺灣報道過1例血清學表現(xiàn)為AelBel，但其父母基因型卻分別為B101型和A102O02型，通過單體型基因?qū)W檢測證實其為A102O02/B101O02嵌合血型。這里呈現(xiàn)的弱嵌合體血型，推測原因可能是編碼低活性的A轉(zhuǎn)移酶遺傳或A102O02與B101O02相互影響導(dǎo)致。

自1952年Dunsford等[4]報道了第一例嵌合體血型現(xiàn)象到目前，全球已發(fā)現(xiàn)了近百例先天性血型嵌合體。血型嵌合體不僅表現(xiàn)在ABO血型系統(tǒng)，其他血型系統(tǒng)如P、Kidd以及Duffy系統(tǒng)中也可存在。目前的研究[5]表明具有嵌合體血型的人，其紅細胞在做ABO血清學檢測時常呈現(xiàn)混合外觀視野，但常規(guī)的玻片法、試管法等鑒定時并不容易發(fā)現(xiàn)，具有高靈敏度的微柱凝膠卡法也只能懷疑，嵌合體血型弱抗原也不能通過吸收釋放試驗與抗原減弱區(qū)分開來，確診還需要借助DNA血型分型技術(shù)。嵌合體現(xiàn)象常常會導(dǎo)致ABO血型遺傳不符合經(jīng)典遺傳規(guī)律[6]。具體到本例先證者，其外表正常，分娩時并無雙胞胎、輸血史和干細胞移植史，其血清學結(jié)果為AB型，但其紅細胞凝集不典型(混合視野)，基因定型顯示可能含有A102/B101/O02等位基因。家系調(diào)查結(jié)果顯示其父為B型，基因型為B101O02；母為A型，基因型為A102O01；初步懷疑先證者為嵌合體或者亞型。第6、7外顯子測序結(jié)果表明先證者具有A102/B101/O02共3個等位基因，B101和O02可能來自于其父，而A102來自于其母。先證者的遺傳因素導(dǎo)致在3個等位基因存在的情況下，A與B轉(zhuǎn)移酶未能充分發(fā)揮作用，血型鑒定時呈現(xiàn)混合凝集外觀。先證者未能顯示4個等位基因可能是在一個合子中產(chǎn)生的細胞遺傳學異常的結(jié)果，例如三體型，額外的染色體來自一個親本。

嵌合體血型應(yīng)引起重視。一方面嵌合體血型誤診能引起嚴重的輸血反應(yīng)[7]。有1例61歲患者因移植術(shù)后高血壓癥、Hct降低，輸入280 mL的O型紅細胞(與此獻血者為雙胞胎，血液中含少量B抗原)幾小時后發(fā)生嚴重溶血。另一方面血型嵌合體免疫耐受的研究對基因干細胞移植和骨髓移植有著深遠的影響。已經(jīng)有越來越多的研究[8]表明異基因干細胞移植以及骨髓移植之后形成的微嵌合狀態(tài)，對受體和移植物均有影響，并且可能有利于宿主對移植物的免疫耐受，能夠在一定程度上反映移植物的狀態(tài)。目前通過適當方法檢測受者體內(nèi)嵌合體的分布及數(shù)量變化可用于評估及預(yù)測移植后的排斥反應(yīng)、移植物抗宿主反應(yīng)以及一些自身免疫性疾病。