HDFN的診斷方法研究進展

廖忠　陳宇南

【摘要】 胎兒和新生兒溶血性疾?。℉DFN）基本原因是指某些婦女在懷孕期間暴露于父系衍生的紅細胞抗原或在其既往輸血史中暴露于非自體抗原， 紅細胞致敏。一旦被致敏， 未來懷孕可能導致HDFN。近幾十年來， HEAs檢測是重要輸血試驗組成部分[1]。傳統(tǒng)上， 這種檢測是在患者或供體單位紅細胞（RBCs）上進行的， 使用的試劑抗血清具有明確的抗原特異性和凝集點。多種血型抗原的同種異體抗體與HDFN有關聯(lián)， 可見于ABO、RH及MN等血型系統(tǒng)。HDFN可能導致嚴重的溶血、黃疸和核黃疸。在我國， ABO相關HDFN比例最多， 而RH（-）人群僅占0.4%， 低于白種人15%[2]。其他血型系統(tǒng)則更為罕見。一旦發(fā)病， 病后預后極差， 所以先期診斷則顯得尤為關鍵。需要適當?shù)脑\斷工具來區(qū)分HDFN與其他紅細胞相關原因的妊娠免疫和黃疸的肝或感染性病因。HDFN由于其高發(fā)病率和嚴重的臨床癥狀， 應確保早發(fā)現(xiàn)、早治療。

【關鍵詞】 溶血性疾病;血型系統(tǒng);胎兒;新生兒;抗原;抗體

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.36.107

1 血清學方法

關于產(chǎn)前診斷， 如果發(fā)現(xiàn)有臨床意義上的同種異體抗體， 或者有前一個胎兒或新生兒受到HDFN的影響， 最初是通過確定胎兒RBCs中相應抗原的存在與否來確定HDFN的胎兒風險[3]。

為預防及避免HDFN的發(fā)生， 妊娠婦女除行常規(guī)的產(chǎn)前檢查外， 還應包括妊娠史、流產(chǎn)史、HDFN史及夫妻雙方的ABO和Rh血型的鑒定、不規(guī)則抗體篩選。而目前臨床檢測血型最為常用的方法， 其原理是讓待測樣本紅細胞和標準血清中血型抗原和抗體在液體介質(zhì)中發(fā)生凝集反應， 通過肉眼識別判斷血型表型。常用的方法有玻片法、試管法等。在此基礎上改良的微柱凝膠法[4]， 進一步提高了檢測的準確性， 且具有所需樣本少、抗干擾能力強等優(yōu)勢。盡管有研究表明[5]， HDFN的發(fā)病率隨母體內(nèi)抗-A/B或抗-RhD水平的升高而遞增， 但仍有一些高抗體水平的個體并沒有發(fā)生HDFN， 而一些低抗體水平的個體發(fā)生了中至重度的HDFN。對那些有過流產(chǎn)史、HDFN史的孕婦， 應該密切注意其體內(nèi)的血清抗體水平。

血清學方法可用于孕婦在懷孕早期的弱抗體檢測， 血清學分析的優(yōu)勢來自于其敏感性和靈活性， 這使得在妊娠早期抗體滴度較低時即可發(fā)現(xiàn)和鑒定。但其局限性在于實驗須在標準化條件下進行， 且檢測出來的抗體滴度與HDFN疾病嚴重程度之間的相關關系仍然欠缺。另外， 對HEAs進行血清學檢測還有其他局限性。例如， 需要抗原特異性抗原。在某種程度上， 這大概是因為滴定法結(jié)果本身就是一種不精確的抗體濃度測量方法。同時， 對于許多臨床相關的HEAs， 也沒有商用的抗血清（如V抗原）。如果單個樣本必須檢測多個抗原， 那么特定的抗血清的成本依然比較昂貴。血清學檢測是人力成本較高， 需要有經(jīng)驗的技術人員才能獲得與凝集測試的主觀終點一致的結(jié)果。

血清學類型的方法可能需要耗費大量的人力和時間， 并且需要穩(wěn)定可靠的抗血清。如前所述， 如果血液樣本中含有來自最近輸液的持續(xù)供體細胞， 或者通過間接凝集作用在樣本上使用陽性的直接抗人球蛋白試驗（DAT）進行輸入， 就不能在不修改的情況下使用它們。改良的血清學方法并不總是成功的， 它們不能用于某些常見的抗原。近年來， 分子分型（基因型測試）已成為一種替代方法， 可以克服血清型分型的許多缺點， 同時也能增加與輸血管理相關的新信息。

2 分子分型方法

在許多情況下， 這種血清學檢測有嚴重的局限性。而分子診斷測試方面的進展， 克服了血清學檢測的局限性， 使實驗室能夠檢測特定位點的編碼序列， 從而可以推斷出抗原的狀態(tài)。在分子水平上， 抗原變異是基于對HEA基因編碼的DNA序列變異， 如單核苷酸多態(tài)性（SNPs）、插入或缺失。例如， RHCE基因（676G>C） 密碼子226的單核苷酸變化是E/e等位基因的基礎[6]。

因此在分子生物學基礎上， 開發(fā)了多種血型基因分型方法[7]， 常見的有限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈式反應（PCR）法、單鏈構象多態(tài)性PCR法、擴增產(chǎn)物長度多態(tài)性PCR法、等位基因特異性引物消耗法、突變位點分離PCR法以及DNA芯片法、直接測序法等。當父親為雜合或父系接合性未知時， 胎兒紅細胞抗原決定需要通過胎兒血型基因分型來進行進一步的管理。運用PCR-序列特異性引物（SSP）、PCR-限制片段長度多態(tài)性（RFLP）等[8]分子生物學技術可從懷孕16周的孕婦羊水細胞中檢測出胎兒的血型基因， 對于有 HDFN 史或流產(chǎn)史的婦女， 其丈夫基因為雜合型者， 用分子生物學技術可以更早、更準確地預測胎兒的血型基因型， 可有選擇性終止RhD陽性胎兒的妊娠， 避免對RhD陰性胎兒的一些侵入性損害檢查[9]。可檢測的血型基因型有RhD、c、E、Cw、K、Fya、Fyb、Jka、Jkb 等。在 ABO HDFN 的預測中， 如母親為O型， 父親為AO /BO型的夫婦， 檢測其胎兒ABO血型基因型， 如胎兒為O型， 完全可以排除HDFN發(fā)生的可能， 避免其他不必要的檢測。如胎兒為AO/BO基因型， 則提示有發(fā)生HDFN的可能， 從而指導臨床在必要時進行其他檢測。

盡管分子遺傳學在未來可能發(fā)揮更大的作用。但與所有的方法一樣， 分子抗原類型有其優(yōu)點， 但也有其局限性。因為技術、醫(yī)學和遺傳缺陷導致表型（在紅細胞表面上表達的）與基因型（編碼基因）不同。大多數(shù)基于DNA的擴增都不排除檢測中沒有表達的基因， 這可能導致抗原檢測假陽性。另一方面， 不是所有的血型多態(tài)性都可以很容易的分析[10]， 例如， 如果大量的等位基因編碼一個表型（例如ABO、Rh和null表型）;或具有大片段缺失的等位基因（如Ge-）或由混合基因編碼的等位基因（例如在Rh和MNS系統(tǒng)中）;或者當分子基礎未知時（例如Vel、Lan、Jra）。此外， 并不是所有種族的所有等位基因都是已知的[11]。

3 標本采集

胎兒血型基因分型樣本來源于幾種胎兒DNA。傳統(tǒng)上包括羊膜穿刺術、臍帶穿刺術和絨毛膜絨毛取樣（CVS）和經(jīng)陰道灌洗獲得的子宮頸組織的胎兒細胞。每一種都對胎兒有風險， 而且與樣品質(zhì)量有關。經(jīng)陰道灌洗獲得的宮頸組織則胎兒DNA的豐度低， 而母體DNA、羊膜穿刺術、角膜穿刺術和CVS感染的可能性較高， 并增加了妊娠期出血的風險， 增加了母體致敏的風險。以往， 羊膜細胞是胎兒血型基因分型的首選來源， 因為相對于其他方法， 羊膜穿刺術的安全性較好。然而， 即使是羊膜穿刺術也有0.3%～1.0%的流產(chǎn)風險和3%～17%的胎盤出血[12]。早期產(chǎn)前診斷胎兒DNA的非侵入性產(chǎn)前診斷方法的出現(xiàn)， 已經(jīng)消除了這些擔憂， 并極大地提高了對胎兒組織進行分子檢測的能力。

在過去的幾十年里， 監(jiān)測胎兒危險的侵入性程序已經(jīng)被放棄。胎兒血型分型可在妊娠期間孕婦血漿中使用無細胞胎兒DNA。胎兒貧血可通過多普勒超聲檢查， 以確定需要宮內(nèi)輸血的胎兒。最后， 強化光療法是一種安全的干預手段， 以降低膽紅素水平， 以預防核黃疸。由于母體抗體在這一時期保持活躍， 受感染的新生兒在出生后的幾個月可能需要一次或更多的輸血。

4 未來趨勢

在血型分類中， 最有潛力但依然在實驗階段的新方法是診斷微陣列的發(fā)展。DNA以及蛋白質(zhì)和碳水化合物微陣列依然處于實驗階段。最大的影響可能來自于目前進行的各種類型的常規(guī)化驗， 包括血型分型和血液捐獻的病原體檢測。微陣列有可能改變這些測試算法， 以在單個平臺上同時測試所有需要的標記， 減少使用專用操作符和特定試劑的多種儀器的成本， 并大大簡化了數(shù)據(jù)處理方面的操作。

如上所述， 大多數(shù)血型抗原都是等位基因， 是SNP的結(jié)果。對于DNA微陣列， DNA分離后的多重PCR擴增了含有SNPs的基因片段。然后將PCR產(chǎn)物雜交到一個含有短等位基因寡核苷酸的陣列中。對于每一個血型， 都有不同的寡核苷酸（正義和反義）。然后用自顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)對整個陣列進行可視化處理， 陣列信息進行解碼， 基因型得分。首次結(jié)果表明， 微陣列將提供一個可靠且快速的程序， 可以進一步改進以提高效率。為測定血型， 研制了蛋白質(zhì)微陣列， 它們是用多種血型抗原特異性抗體標記的。該方法也可用于直接抗球蛋白檢測的微陣列中， 在微陣列表面發(fā)現(xiàn)單克隆抗免疫球蛋白G（IgG）和抗C3d， 并在熒光素異硫氰酸酯標記的熒光素中， 使敏感的RBCs反應。碳水化合物微陣列包含許多不同的多糖， 以一種小型化的形式固定在固體支架上。在相同的條件下， 可以同時對陣列中的每個組件的蛋白質(zhì)、病毒或細胞進行綁定。使用含有不同糖蛋白的碳水化合物微陣列， 可以檢測出A、B、H和Lewis血型的抗體。

參考文獻

[1] Quraishy N， Sapatnekar S. Advances in Blood Typing. Advances in Clinical Chemistry， 2016， 77：221-269.

[2] Malomgré W， Neumeister B. Recent and future trends in blood group typing. Anal Bioanal Chem， 2009， 393（5）：1443-1451.

[3] Wilkinson DS. Clinical Utility of Genotyping Human Erythrocyte Antigens. Laboratory Medicine， 2016， 47（3）：e28.

[4] Keir A， Agpalo M， Lieberman L， et al. How to use： the direct antiglobulin test in newborns. Archives of Disease in Childhood Education & Practice Edition， 2015， 100（4）：198.

[5] Hadley AG. A comparison of in vitro tests for predicting the severity of haemolytic disease of the fetus and newborn. . Vox Sanguinis， 2015， 74（S2）：375-383.

[6] Shields JA. Prenatal typing of fetal DNA in cases of potential alloimmune haemolytic disease of the newborn： clinical benefit outweighs disadvantage. . British Journal of Biomedical Science， 1999， 56（1）：49.

[7] Daniels G， Finning K， Martin P， et al. Fetal blood group genotyping from DNA from maternal plasma： an important advance in the management and prevention of haemolytic disease of the fetus and newborn. Vox Sanguinis， 2010， 87（4）：225-232.

[8] Zhao H， Li B， Li N， et al. Retrospective analysis of 55 twin neonates with haemolytic disease of the newborn. Immunologic Research， 2017， 65（3）：699-705.

[9] Denomme GA， Akoury H， Sermer M， et al. RhD status of a fetus at risk for haemolytic disease with a discrepant maternal DNA-based RhD genotype. Prenatal Diagnosis， 2015， 19（5）：424-427.

[10] Fasano RM. Hemolytic disease of the fetus and newborn in the molecular era. Seminars in Fetal & Neonatal Medicine， 2016， 21（1）：28-34.

[11] Hendrickson JE， Delaney M. Hemolytic Disease of the Fetus and Newborn： Modern Practice and Future Investigations. Transfusion Medicine Reviews， 2016， 30（4）：159-164.

[12] Moise KJ. Hemolytic disease of the fetus and newborn. Clinical advances in hematology & oncology， 2013， 11（10）：664-666.

[收稿日期：2019-03-13]