子宮肌瘤患者孕激素受體的表達(dá)及意義

薛小芳，王玉，王利霞，崔娟，李森森，許振峰

(南陽(yáng)南石醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 南陽(yáng) 473000)

子宮肌瘤的整體發(fā)病率較高，在年齡大于45歲的育齡期女性人群中，子宮肌瘤的發(fā)生率可達(dá)235～545/1萬(wàn)人左右[1]。現(xiàn)階段臨床上主要通過(guò)手術(shù)治療子宮肌瘤，但包括各種方式綜合性治療后的子宮肌瘤患者的復(fù)發(fā)率仍然較高，遠(yuǎn)期二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)仍然超過(guò)5%[2]。

在不同的生物學(xué)分子機(jī)制中，受體水平的改變能夠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞DNA的擴(kuò)增，促進(jìn)平滑肌瘤的發(fā)生。孕激素受體（progesterone receptor，PR）的激活能夠誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞DNA持續(xù)性擴(kuò)增，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和間質(zhì)成分的增生，促進(jìn)肌瘤的形成[3，4]。PR-A/B是傳統(tǒng)的PR，其在促進(jìn)PR受體的激活、平滑肌細(xì)胞的纖維化等方面發(fā)揮了重要的作用；PR-M是新型的PR，近年來(lái)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)PR-M能夠通過(guò)影響平滑肌細(xì)胞的線粒體代謝活性，促進(jìn)ATP能量利用的增加等，顯著促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和間質(zhì)成分的代償性增生[5]。為了進(jìn)一步揭示PR-M、PR-A/B等因子與子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞增殖的關(guān)系，本次研究選取2017年1月至2017年12月我院保存的子宮肌瘤組織標(biāo)本21例，探討了不同亞型受體的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 組織來(lái)源 選取2017年1月至2017年12月我院保存的子宮肌瘤組織標(biāo)本21例，年齡34～46歲，平均年齡（41.24±8.46）歲。同時(shí)選取距子宮肌瘤＞5cm正常子宮平滑肌組織作為對(duì)照，納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴行子宮全切手術(shù)；⑵未絕經(jīng)婦女；⑶多發(fā)性子宮肌瘤＜5個(gè)；⑷患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴術(shù)前3個(gè)月服用過(guò)類固醇激素類藥物；⑵伴有其他內(nèi)分泌合并癥。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟至水，過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3%H2O2，室溫10min（避光），10mMpH 6.0 枸櫞酸鈉緩沖液），PBS 沖洗5min，滴加正常山羊或兔血清封閉處理，37℃，15min。用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加第一抗體，37℃ 2h， 滴加生物素化的二抗，37℃，40min，PBS沖洗5min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，加拿大樹(shù)膠（或中性樹(shù)膠）封片。

PR以細(xì)胞核呈棕黃色為陽(yáng)性，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野對(duì)細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分，兩種評(píng)分之和≥3分為陽(yáng)性表達(dá)。染色強(qiáng)度：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞比例：＜10%為0分，10%～30%為1分，31%～60%為2分，＞60%為3分。

1.2.2 儀器與試劑 DMEM、DMEM-F12培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA、PBS、Ⅰ型膠原酶(索萊寶公司)，SP試劑盒、DAP染色試劑盒(北京中山金橋公司)。

1.2.3 細(xì)胞分離、培養(yǎng) 使用10%的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24~48h待細(xì)胞貼壁（融合度80%左右）進(jìn)行第1次換液，以后每2～3d更換一次培養(yǎng)基，采用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。

1.2.4 CCK-8檢測(cè) 在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔），向每孔加入 10μl CCK8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1~4h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度，若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液，24h內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 采用組織研磨法研磨子宮平滑肌組織，冰上放置30min，進(jìn)行Bradford比色法檢測(cè)平滑肌瘤組織的蛋白濃度，采用BSA緩沖液配比（1：4），加入電泳緩沖液（比例 1：1），上樣、電泳（濃縮膠20mA，分離膠35mA），電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（100mA 40min），10%的高脂蛋白封閉，加入養(yǎng)來(lái)源一抗（1：1000），封閉 4h，PBS 緩沖液洗滌 3次，每次 5min，加入鼠來(lái)源二抗（1；2000），PBS 緩沖液洗滌3次，每次5min，采用AP/NBT顯色法，進(jìn)行常規(guī)的曝光和膠片的灰度讀取。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料采用（）表示，組間比較使用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 子宮肌瘤和正常子宮平滑肌標(biāo)本PR表達(dá)比較 子宮肌瘤組織PR陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常子宮平滑肌組織（P＜0.05），見(jiàn)表 1和圖 1。

表1 子宮肌瘤和正常子宮平滑肌標(biāo)本PR表達(dá)比較

圖1 免疫組化圖

2.2 子宮肌瘤和子宮平滑肌細(xì)胞PR-A、PR-B、PR-M表達(dá)比較 子宮肌瘤細(xì)胞PR-A、PR-B、PRM蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于子宮平滑肌細(xì)胞 （P＜0.05）。 見(jiàn)表 2。

表2 子宮肌瘤和子宮平滑肌細(xì)胞PR-A、PR-B、PR-M蛋白表達(dá)（，n=6)

表2 子宮肌瘤和子宮平滑肌細(xì)胞PR-A、PR-B、PR-M蛋白表達(dá)（，n=6)

細(xì)胞 PR-A蛋白相對(duì)表達(dá)量子宮肌瘤子宮平滑肌PR-B蛋白相對(duì)表達(dá)量PR-M蛋白相對(duì)表達(dá)量t P 0.762±0.116 0.341±0.120 6.179＜0.05 0.987±0.107 0.543±0.112 7.021＜0.05 0.097±0.042 0.010±0.002 5.068＜0.05

2.3 不同PR表達(dá)類型子宮肌瘤細(xì)胞增殖情況比較 篩選出僅表達(dá)PR-M的細(xì)胞株 （PR-M陽(yáng)性組）和僅表達(dá)PR-A/B的細(xì)胞株（PR-M陰性組）進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)，PR-M陽(yáng)性組培養(yǎng)24h、48h OD值明顯高于PR-M陰性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見(jiàn)表 3。

表3 不同PR表達(dá)類型子宮肌瘤細(xì)胞增殖情況比較（，n=6)

表3 不同PR表達(dá)類型子宮肌瘤細(xì)胞增殖情況比較（，n=6)

組別 0h PR-M陽(yáng)性組PR-M陰性組t P 0.211±0.087 0.204±0.090 0.137＞0.05 24h 48h 0.352±0.097 0.234±0.071 2.404＜0.05 0.411±0.091 0.301±0.089 2.117＜0.05

3 討論

不同的生物學(xué)因子機(jī)制均可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞再生和纖維化等病理改變的進(jìn)程，提高子宮肌瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。但現(xiàn)階段臨床上因子宮肌瘤導(dǎo)致的子宮切除率明顯上升，同時(shí)子宮肌瘤的持續(xù)性進(jìn)展率、復(fù)發(fā)率等指標(biāo)仍然較高[6，7]。一項(xiàng)包括了261例子宮肌瘤患者的治療隨訪研究提示，臨床上子宮肌瘤手術(shù)治療后的肌瘤復(fù)發(fā)率、肌瘤變性的風(fēng)險(xiǎn)可超過(guò)7%[8]。而通過(guò)對(duì)于子宮肌瘤發(fā)病過(guò)程中PR受體水平的相關(guān)分子亞型的分析，具有下列幾個(gè)方面的意義：⑴能夠?yàn)榕R床上子宮肌瘤患者的生物學(xué)靶向治療提供理論基礎(chǔ)；⑵能夠?yàn)樽訉m肌瘤高危人群的篩查提供依據(jù)。

PR受體與雌激素信號(hào)通路具有一定的交錯(cuò)式的激活效應(yīng)，PR受體水平的激活不僅可以通過(guò)激活PR下游信號(hào)通路，還能夠通過(guò)增加雌激素下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的激活程度，促進(jìn)雌激素對(duì)于平滑肌細(xì)胞的促增殖作用[9，10]。PR-A/B作為主要的PR受體亞型，其在子宮肌瘤發(fā)病過(guò)程中的作用已經(jīng)得到了多數(shù)研究的證實(shí)，而關(guān)于PR-M的分析研究不足?；A(chǔ)方面的研究提示，PR-M主要定位于線粒體膜周邊，其與配體結(jié)合后導(dǎo)致的線粒體轉(zhuǎn)錄活性的增加，能夠促進(jìn)ATP能量利用率的上升，提高平滑肌細(xì)胞的代謝水平，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖[11，12]。同時(shí)，PR-M受體亞型的改變，還能夠提高平滑肌增殖過(guò)程中局部新生血管形成的速度，提高病灶部位血流灌注水平。

本次研究首先通過(guò)免疫組化分析探討了PR的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PR的整體表達(dá)水平明顯上升，提示PR能夠參與到子宮肌瘤的病情進(jìn)展過(guò)程，PR主要通過(guò)影響到受體信號(hào)通路的激活效應(yīng)，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和間質(zhì)成分的代償性增生過(guò)程。免疫組化染色分析可見(jiàn)，PR蛋白主要染色于平滑肌細(xì)胞較為密集的區(qū)域，特別是在間質(zhì)成分增生明顯、平滑肌細(xì)胞形態(tài)改變較為顯著的區(qū)域，PR的染色強(qiáng)度更深，PR的表達(dá)陽(yáng)性率更高。汪偉等[13]研究者也認(rèn)為，PR在子宮肌瘤患者病灶組織中的表達(dá)陽(yáng)性率可平均上升25%，同時(shí)在復(fù)發(fā)率子宮肌瘤或者巨大型子宮肌瘤病灶組織區(qū)域中，PR的上升更為明顯。在細(xì)胞水平進(jìn)行蛋白的表達(dá)分析研究，發(fā)現(xiàn)子宮肌瘤細(xì)胞PR-A、PR-B、PR-M蛋白表達(dá)量均明顯高于普通的平滑肌細(xì)胞，差異較為明顯，提示了PR-A、PR-B、PR-M蛋白均參與到了平滑肌細(xì)胞的增殖和子宮肌瘤的形成過(guò)程，不同的受體亞型的變化，對(duì)于子宮肌瘤細(xì)胞的形成和增殖狀態(tài)的維持作用，主要由于其對(duì)于細(xì)胞代謝水平的改變或者細(xì)胞周期的調(diào)控作用有關(guān)，但具體的機(jī)制仍然要增加樣本量、設(shè)立基礎(chǔ)研究對(duì)照組進(jìn)一步分析。最后本研究發(fā)現(xiàn)，PR-M陽(yáng)性組培養(yǎng)24h、48h OD值明顯高于PR-M陰性組，OD值的提升提示了PR-M陽(yáng)性組子宮肌瘤細(xì)胞的增殖活性較高，表明PR-M對(duì)于子宮肌瘤細(xì)胞具有顯著的促增殖作用，其促增殖活性明顯強(qiáng)于PR-A、PR-B組，這主要由于PR-M能夠直接影響到平滑肌細(xì)胞的內(nèi)部細(xì)胞器的代謝、提高線粒體的能量代謝活性[14-16]。

綜上所述，子宮肌瘤組織以及細(xì)胞PR表達(dá)升高，其中PR-M蛋白可能與子宮肌瘤細(xì)胞增殖有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。