CHD8蛋白與乙肝相關(guān)性肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)性分析

陳慧娟，王培曉，黃麗虹，陳新國，張紅英，張慶（.中國人民解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心，北京 00039；.河南省兒童醫(yī)院，河南 鄭州 45008）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌。2018年世界將約有1 810萬新發(fā)癌癥病例和960萬癌癥死亡病例,其中約有84.1萬例新發(fā)肝癌，78.2萬例肝癌死亡,而中國仍然是肝癌的高危地區(qū)［1］。目前手術(shù)切除或肝移植依舊是最好的治愈手段，但術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)是影響患者生存率的重要因素。因此，探索肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)機(jī)制變得尤為重要。

以往研究發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)可以引起癌癥中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。其中染色體結(jié)構(gòu)域解旋酶DNA結(jié)合蛋白8（chromodomain helicase DNA-binding protein 8，CHD8）編碼的CHD8蛋白就是一種ATP依賴的含染色質(zhì)和SNF2-related helicase /ATPase結(jié)構(gòu)域的染色質(zhì)重塑蛋白，有研究提示該基因可能通過與其他基因的相互作用參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［2］。目前CHD8與肝癌的相關(guān)研究尚無報道。

1 材料與方法

1.1 研究對象：回顧性分析2007年1月—2012年6月期間，中國人民解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心收治的251例肝移植術(shù)的乙肝相關(guān)性HCC患者的臨床及隨訪資料。所有患者肝移植術(shù)前均被檢測為乙肝表面抗原陽性，肝移植后病理均確診為HCC，隨機(jī)選取5例正常供肝組織（健康供肝者的肝穿標(biāo)本）作為對照組，251例患者隨訪截止至2017年12月。

1.2 材料及標(biāo)本處理：術(shù)中采集的251例病肝標(biāo)本、鄰近癌旁組織及5例正常供肝組織標(biāo)本經(jīng)固定、包埋后切片。CHD8蛋白抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。山羊抗兔IgG/HRP聚合物購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片脫蠟水化，PBS緩沖液中洗滌3 min×3次，采用高溫高壓法進(jìn)行組織修復(fù)（2.5 min），PBS緩沖液洗滌3 min×3次，放入3%的雙氧水中（10 min）除去內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌后加一抗，4℃冰箱過夜，PBS洗滌3次，二抗37℃溫育20 min，PBS洗滌3次，新配置DAB顯色，顯微鏡下觀察，陽性顯色為棕黃色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，氨水返藍(lán)，梯度乙醇由低到高脫水干燥，中性樹脂封片。

1.3.2 染色結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)：陽性染色呈棕黃色顆粒，強(qiáng)度由弱至強(qiáng)分別記分：無黃色顆粒樣沉淀為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、深棕黃色為3分。陽性細(xì)胞百分比對應(yīng)的值：陽性的細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。染色強(qiáng)度+陽性細(xì)胞百分比記分：陰性為0分，+為1～2分，++為3～4分，+++為5～6分。

1.4 復(fù)發(fā)判斷指標(biāo)：在肝移植術(shù)后的隨訪期間，腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移主要通過監(jiān)測血清甲胎蛋白水平、腹部B超、胸部X線或3～6個月進(jìn)行一次腹部CT或MRI掃描，以及全身骨掃描來協(xié)助診斷。必要時可進(jìn)行肝臟穿刺活檢明確是否復(fù)發(fā)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：CHD8基因的表達(dá)強(qiáng)度與251例肝癌患者的臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析，兩組比較采用mann-whitney U 檢驗，多組間比較采用Kruskal-wallis H檢驗相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以上均采用SPSS 11.0軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 CHD8在乙肝相關(guān)性肝癌組織中的表達(dá)（表1）：結(jié)果顯示，CHD8在癌組織中表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核和細(xì)胞間質(zhì)未見陽性表達(dá)，陽性染色呈棕黃色顆粒（圖1）。CHD8在癌組織中表達(dá)的陽性率為65.3%，中-強(qiáng)陽性率（++～+++）為47.8%；在癌旁組織中表達(dá)的陽性率為84.9%，中-強(qiáng)陽性率為75.7%。對照組中的表達(dá)陽性率80%。結(jié)果顯示CHD8在肝癌組織的陽性表達(dá)率低于臨近的癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 CHD8在乙肝相關(guān)性肝癌組織中的表達(dá)

圖1 CHD8在乙肝相關(guān)性HCC組織中陽性表達(dá)（200×）

2.2 CHD8在癌組織中表達(dá)與肝癌臨床病理指標(biāo)（表2）：本研究表明，CHD8的表達(dá)與術(shù)前的微衛(wèi)星灶（P＜0.01）、血管侵犯（P＜0.01）密切相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。并且CHD8在肝癌中的表達(dá)與肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)（P=0.01）、肺轉(zhuǎn)移（P=0.04）、除肝及肺外其他部位（骨、腦、腎上腺等）轉(zhuǎn)移（P=0.00）具有相關(guān)性，與肝內(nèi)復(fù)發(fā)無相關(guān)性（P＞0.05）。

表2 CHD8在癌組織中的表達(dá)與肝癌臨床病理指標(biāo)及術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)性分析

2.3 CHD8在癌組織中的表達(dá)與術(shù)前乙肝指標(biāo)的相關(guān)性（表3）：研究結(jié)果表明,在乙肝相關(guān)性的肝癌患者中，腫瘤中CHD8的表達(dá)與乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）（P=0.04）具有相關(guān)性，而與乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA的水平無關(guān)。

表3 CHD8在癌組織中的表達(dá)與術(shù)前乙肝指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

正常的染色質(zhì)調(diào)節(jié)是維持基因組功能的核心，而異常的染色質(zhì)調(diào)節(jié)是癌癥發(fā)生的驅(qū)動因素，如白血病中染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子的突變常導(dǎo)致了大量造血干細(xì)胞成為白血病干細(xì)胞［3］。CHD8基因?qū)儆谌旧w結(jié)構(gòu)域解旋酶DNA結(jié)合蛋白家族成員，它是孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）中最常見的突變基因之一,近些年來愈來愈多的研究發(fā)現(xiàn)該基因在多種腫瘤存在較高的突變，如胃癌組織中CHD8 mRNA的表達(dá)顯著降低，并且降低CHD8的表達(dá)能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖［4-5］，結(jié)直腸癌中CHD8的拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）與結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險相關(guān)，并且CHD8較高的突變率顯示出CHD8的表達(dá)缺失［6-7］。同時CHD8在乳腺癌［8-9］、前列腺癌母細(xì)胞性漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞腫瘤［10］、結(jié)節(jié)性硬化癥相關(guān)腎透明細(xì)胞癌［11］中都存在突變。這些改變可能通過CHD8介導(dǎo)的染色質(zhì)重塑失調(diào)而促成癌癥的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。

目前關(guān)于CHD8與肝癌發(fā)生發(fā)展的研究國內(nèi)外尚無報道。本文首次探索了CHD8在肝癌組織中表達(dá)情況及其臨床意義。研究結(jié)果顯示，CHD8在肝癌組織中陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，在乙肝相關(guān)性肝癌中的表達(dá)主要與患者術(shù)前微衛(wèi)星灶、血管侵犯等腫瘤病理指標(biāo)顯著相關(guān)，以往研究表明腫瘤血管侵犯和腫瘤肝外侵犯是HCC肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)CHD8在肝癌組織中的陽性表達(dá)還與肝移植術(shù)后肺轉(zhuǎn)移及其他遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。因此認(rèn)為CHD8在癌組織中過表達(dá)可能與肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，本文研究結(jié)果提示CHD8的表達(dá)與HBeAg有相關(guān)性，Yamasak等［14］研究發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性導(dǎo)致持續(xù)性HBV感染中HCC發(fā)病的風(fēng)險增加，而對于肝癌切除術(shù)后的患者，血清HBeAg陽性對復(fù)發(fā)和長期存活均有負(fù)面影響［15］。HBeAg能引起肝臟炎癥反應(yīng)，增加肝硬化及肝癌的發(fā)生風(fēng)險［16］，且HBeAg能損害抑癌基因P53的活性［17］。既往文獻(xiàn)報道CHD8可以調(diào)節(jié)P53與Wnt通路的關(guān)鍵因子β-catenin蛋白，而P53是一個重要的抑癌和促凋亡基因［18］，因此CHD8的表達(dá)可能受HBV復(fù)制的影響，與肝癌的發(fā)生相關(guān)。目前CHD8在肝癌中的作用機(jī)制尚不明確，Bae等［19］和Sawada等［20］通過酵母雙雜交篩選發(fā)現(xiàn)，CHD8可以與β-連環(huán)蛋白結(jié)合，抑制β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄，以及對細(xì)胞周期調(diào)控中的作用，包括促進(jìn)參與G1 / Stransition的E2F靶基因的轉(zhuǎn)錄［21］，而CHD8的消耗能增強(qiáng)HOXA2表達(dá)，調(diào)節(jié)染色質(zhì)修飾酶的募集［22］。本文推測肝癌組織中的CHD8低表達(dá)可能引起P53的調(diào)節(jié)下降，導(dǎo)致P53對DNA修復(fù)和促凋亡功能下降，使損傷的DNA存活克隆致使腫瘤的形成，但需進(jìn)一步研究證實。

綜上，我們的研究初步表明CHD8蛋白的表達(dá)與肝移植術(shù)后，乙肝相關(guān)性肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能作為CTNNB1及P53的調(diào)控因子參與了肝癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移［7，20，23］。