腫瘤抑制基因1在宮頸鱗癌及子宮內(nèi)膜腺癌中的表達

王冠 王莉莉 邢焱玲 王爽 段麗 張慧晶 高洪菊

宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌是婦科常見惡性腫瘤，并且近年來的發(fā)病率在持續(xù)增長，如果得不到及時有效的治療，可能會對患者今后的健康和生活產(chǎn)生影響，但是現(xiàn)階段臨床醫(yī)學尚未明確兩種疾病的具體發(fā)病機理。此外，盡管部分患者接受了早期的有效治療，并且做到了對宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌的根治和預后，但是部分患者在治療之后會出現(xiàn)局部復發(fā)或病灶轉移的現(xiàn)象，由此可見，研究子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機制的重要性[1-3]。宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌病理類型分別以宮頸鱗癌和子宮內(nèi)膜腺癌較常見。為便于采集病理標本，保證實驗數(shù)據(jù)的準確性，本實驗選取的研究對象定位于宮頸鱗癌及子宮內(nèi)膜腺癌患者。現(xiàn)將結果匯報如下：

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取婦科常見的宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌患者作為本次研究對象。整理收集2017年1—11月我院婦科治療的30例宮頸鱗癌患者的宮頸病理組織作為研究組1的研究對象，同時相應選取30例經(jīng)宮頸液基細胞學證實無異常的宮頸病理標本作為對照組1的研究對象。另選取30例子宮內(nèi)膜腺癌患者的子宮內(nèi)膜病理標本作為研究組2的研究對象，同時選取30例子宮平滑肌瘤患者正常子宮內(nèi)膜病理標本作為對照組2。所有患者術前均未接受放、化療等治療；患者均為已婚已育婦女。

1.2 方法

采用免疫組織化學方法檢測宮頸鱗癌及子宮內(nèi)膜腺癌標本及對照組標本，對其MTSS1的表達情況進行判定。應用實時熒光定量PCR（q-PCR）測引物序列及Western 蛋白印跡法對MTSS1的表達情況進行判定。

1.2.1 免疫組織化學檢測方式 選擇3μm的組織切片，對其進行脫蠟、水化處理，用pH值為6.0的檸檬酸鹽緩慢的沖洗組織切片3 min；隨后用蒸餾水沖洗組織切片，PBS沖洗12 min，并在除去PBS每張切片加入MTSS1抗體、Gli1抗體，具體是將組織切片放置在溫度為37℃的環(huán)境中孵育45 min，隨后用蒸餾水沖洗，PBS沖洗12 min，除去組織切片中的PBS后加入第二抗體，將切組織切片放置在溫度為37℃的環(huán)境中孵育25 min，隨后用蒸餾水沖洗，PBS沖洗12 min；在每張組織切片中加入DAB顯色液，在室溫環(huán)境中另其顯色3～5 min，隨后用蒸餾水沖洗，用蘇木素復染沖洗30 s，在其中添加1%鹽酸酒精，隨后用蒸餾水沖洗，對酒精進行脫水，最終用中性樹膠封閉組織切片。并比較兩組實驗組織中MTSS1和Gli蛋白的表達情況。陽性判斷指標[4-5]：患者的MTSS1蛋白在染色后呈現(xiàn)出淡黃色、棕黃色、棕褐色，本次實驗研究的每張組織切片最終病理確診工作均由兩位病理醫(yī)師共同完成，具體應用的是二級計分法，并選擇5個高倍視野進行觀察，積分元素為染色強度和陽性細胞所占百分比。MTSS1蛋白陽性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色，定位于胞質中；每張切片均需由兩位病理醫(yī)師觀察，采用二級計分法，觀察5個高倍視野，具體的染色強度積分指標如下：淡黃色1分，深黃色2分，棕黃色、棕褐色3分；陽性細胞所占百分比積分指標如下：0%～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～5%為3分，超過75%為4分。染色強度和陽性百分比的乘積＞3分為免疫反應陽性，按乘積分數(shù)將染色結果分為4個等級：0～2分為陰性（-）；3～5分為弱陽性（+）；6～8分為中度陽性（++）；9～12分為強陽性 （+++）。

1.2.2 q-PCR檢測 將患者的組織標本分成二份，一份在液氮下磨碎，并用TRIzol 試劑盒提取RNA，檢測RNA在波長260 和280 nm 處的光密（D）值（使用紫外分光光度儀），逆轉錄成為 cDNA 后，再通過引物進行PCR的擴增，測引物序列[6-7]。

1.2.3 Western蛋白印跡法 選擇兩份組織標本中經(jīng)過了液氮凍存的一份，在其中加入蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液，隨后將其放在冰上孵育20 min，進行離心操作10 min，取其中的上清，測量其蛋白濃度，按照1∶4的比例混合緩沖液和蛋白樣品，隨后將其放在沸水中加熱5 min，待冷卻后進行離心操作30 s[8-9]。選擇適量樣本進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將其轉移到纖維素膜之上，封閉1 h后進行MTSS1抗體孵育，隨后將處理好的樣本放置在溫度為4℃的搖床中一夜，次日用含有0.1% Tween20的TBST清洗樣本，將同辣根過氧化物酶標記過的羊抗小鼠IgG二抗放置在室溫環(huán)境中孵育1 h，最后通過暗室ECL法進行成像。判定標準：MTSS1表達判定以蛋白上樣量及曝光強度為依據(jù)，如果高于正常宮頸組織和子宮內(nèi)膜組織（所有正常組織樣本等量混勻）視為陽性，反之視為陰性。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0分析和統(tǒng)計數(shù)據(jù)，計數(shù)資料應用χ2檢驗，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化方法檢測MTSS1陽性表達率

研究組1（宮頸鱗癌患者）中MTSS1陽性表達率為 53.33%，對照組1中MTSS1陽性表達率為23.23%；研究組MTSS1陽性表達率明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

研究組2（子宮內(nèi)膜腺癌患者）中MTSS1陽性表達率為56.67%，對照組2中MTSS1陽性表達率為16.67%。研究組MTSS1陽性表達率明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 實時熒光定量PCR（q-PCR）測引物序列及Western 蛋白印跡法

研究組1（宮頸鱗癌患者）中MTSS1陽性表達率為63.33%，研究組2（子宮內(nèi)膜腺癌患者）中MTSS1陽性表達率為66.67%。對照組1和對照組2中MTSS1檢測顯示均為陰性。研究組MTSS1陽性表達率明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 結論

綜合國內(nèi)外研究成果，MTSS1在惡性腫瘤的研究中，已經(jīng)成為一個重要的腫瘤抑制因子[10-11]。但是在婦科腫瘤領域中，相關報道甚少[12]，本研究應用免疫組化方法結合q-PCR 及 Western 印跡技術檢測 MTSS1基因及蛋白在宮頸鱗癌和子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達水平，兩種方法所得結論相同：運用免疫組化方法檢測宮頸鱗癌及子宮內(nèi)膜腺癌MTSS1陽性表達率分別為53.33%和56.67%，明顯高于其對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；運用q-PCR及Western 印跡技術檢測實驗證實，宮頸鱗癌及子宮內(nèi)膜腺癌MTSS1陽性表達率分別為63.33%和66.67%，MTSS1在宮頸鱗癌及子宮內(nèi)膜腺癌中的高表達，進一步在蛋白水平證實MTSS1基因的表達可能與其發(fā)生發(fā)展密切相關。今后如將MTSS1列為日后檢查婦科惡性腫瘤標記物之一，則又增加了一種癌癥篩查的診斷方法。