胍丁胺的柱前衍生方法及評價

周 娟，張惠靜，胡嵐嵐 綜述，湯建林△ 審校

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床藥理基地，重慶 400037；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析與分析化學(xué)教研室，重慶 400038)

胍丁胺是精氨酸脫羧基生成的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物、細(xì)菌及哺乳類動物的各種組織中。研究表明，胍丁胺生物學(xué)作用豐富，內(nèi)源性胍丁胺及其相應(yīng)的受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)構(gòu)成了阿片功能的調(diào)節(jié)系統(tǒng)[1]；外源性胍丁胺的初步藥理學(xué)研究證明，胍丁胺能增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛[2]，降低其成癮性及抗耐受作用[3-4]，而且抗抑郁[5-6]和抗焦慮[7]作用明顯，具有良好的研究及應(yīng)用前景[8]。胍丁胺極性強(qiáng)、相對分子質(zhì)量小，其結(jié)構(gòu)中無紫外和熒光吸收基團(tuán)，難以氣化，且內(nèi)源性胍丁胺含量低，生物樣品中干擾成分較多，一般方法難以檢測[9]，因此，對胍丁胺的定量測定成為研究胍丁胺生物學(xué)作用亟待解決的重要問題。近年來，通過衍生化作用改變胍丁胺的極性，增大其在色譜柱上的保留，并增大分析物的相對分子質(zhì)量，使之與內(nèi)源性小分子雜質(zhì)分離[10]，實現(xiàn)內(nèi)源性胍丁胺的定量測定。胍丁胺的柱前衍生定量分析方法主要有柱前衍生化高效液相色譜法(HPLC)、柱前衍生化氣相色譜法、柱前衍生化色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等，這些方法各具特點，因而適用范圍各不相同。目前，常用的衍生化試劑包括鄰苯二甲醛(OPA)類，該試劑與胍丁胺衍生需要巰基試劑的參與，常用的巰基試劑包括巰基乙醇(ME)[11]、巰基丙酸(3-MPA)[12]、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)[13]，以及2,3-萘二甲醛(NDA)[14]、4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜噁二唑(NBD-F)[15]、氯甲酸-9-芴基甲酯(FMOC-Cl)[16]、乙酰丙酮(AA)類[如三氟乙酰丙酮(TFAA)、六氟乙酰丙酮(HFAA)[17]等]。本文對胍丁胺近年來常用的柱前衍生化試劑進(jìn)行了總結(jié)，并對各種衍生試劑的優(yōu)缺點、最佳衍生條件及檢測方法做了比較全面地分析，旨在為后期測定胍丁胺的含量及生物學(xué)研究提供方法與思路。

1 OPA

OPA是目前應(yīng)用最為廣泛的衍生化試劑，在巰基試劑(如ME、3-MPA、NAC等)的作用下胍丁胺和OPA迅速反應(yīng)生成具有較強(qiáng)熒光的異吲哚衍生物，見圖1。該反應(yīng)所需條件較溫和(室溫、堿性)，反應(yīng)迅速，樣品制備簡單，適用于大量生物樣品的分析測定。

圖1 胍丁胺與OPA類衍生試劑的反應(yīng)方程式

1997年FENG等[11]首次利用OPA-ME作為胍丁胺柱前衍生化試劑，通過HPLC熒光檢測器測定大鼠腦內(nèi)及人血漿中胍丁胺的水平。文獻(xiàn)中將50 mg的OPA溶解在1 mL甲醇中，加入53 μL的ME和9 mL的硼酸鉀緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=9.4)混勻，于4 ℃冰箱放置不超過3 d。衍生過程取15 μL的樣品和15 μL的OPA-ME衍生試劑在室溫條件下混合反應(yīng)2 min，后立即取20 μL進(jìn)樣分析。該方法選擇同型半胱氨酸為內(nèi)標(biāo)，靈敏度高，檢出限為0.1 pmol/L。該方法中單一樣本檢測時間長(t=80 min)，因此，并不適合用于常規(guī)檢測。蘇瑞斌等[18]利用OPA-ME柱前衍生化HPLC熒光檢測法測定大鼠不同腦區(qū)及NG-108-15細(xì)胞內(nèi)胍丁胺的含量。結(jié)果顯示正常大鼠不同腦區(qū)和NG108-15細(xì)胞內(nèi)胍丁胺的含量分別為0.80～1.71 μg/g濕腦組織、0.044 mg/g蛋白。宋滇文等[19]選擇微量OPA-ME柱前衍生技術(shù)，通過熒光檢測器測定大鼠脊髓組織中胍丁胺的含量，檢測限可達(dá)到3.85 pmol/L。目前OPA-ME作為胺類化合物柱前衍生試劑應(yīng)用廣泛，但是OPA-ME在反相柱分離過程中部分衍生化合物會發(fā)生裂解，因此，必須嚴(yán)格控制衍生化反應(yīng)的時間。

相關(guān)文獻(xiàn)表明，OPA-3-MPA與多胺的衍生反應(yīng)迅速(<5 min)，且具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度。MARKOWSKI等[12]使用OPA-3-MPA進(jìn)行柱前衍生，通過HPLC熒光檢測器(λex=338 nm，λem=455 nm)測定人體尿液中精氨酸及胍丁胺在內(nèi)的12種代謝產(chǎn)物。方法中稱取40 mg OPA溶解在0.8 mL甲醇中，加入40 μL的3-MPA和7.2 mL硼酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=9.0)混勻，于黑暗低溫中保存不超過2 d。將制備好的50 μL樣品與50 μL的OPA-3-MPA衍生試劑渦旋混合，室溫下精確反應(yīng)2 min，立即取20 μL注入HPLC熒光測定系統(tǒng)中，胍丁胺的檢出限為28 nmol/L，保留時間為44 min。

多胺可以與OPA和NAC反應(yīng)形成相對穩(wěn)定的衍生產(chǎn)物，即OPA-NAC-多胺。DAI等[13]采用HPLC熒光檢測器，以O(shè)PA-NAC作為柱前衍生化試劑，測定豬肝臟、空腸、回腸等組織中的胍丁胺含量。試驗中稱取50 mg OPA和50 mg NAC溶解于1.25 mL甲醇中，加入40 mmol/L硼酸鈉緩沖液(pH 9.5)11.2 mL和0.4 mL Brij@-35，輕輕混勻。該衍生試劑須在HPLC分析當(dāng)天新鮮配制，并避光儲存在4 ℃，24 h內(nèi)使用。此方法特異性強(qiáng)，不受氨基酸的干擾，胍丁胺的保留時間約為9 min，檢測限為0.5 nmol/mL或0.1 nmol/mg生物樣品組織，且衍生化溶液中使用的OPA對HPLC系統(tǒng)沒有不利影響。據(jù)文獻(xiàn)報道，與含有氨基或胺基的物質(zhì)發(fā)生快速衍生化反應(yīng)最佳的OPA濃度為1.95 mg/mL或14.5 mmol/L。OPA-NAC衍生化反應(yīng)具有簡單、快速、靈敏、重現(xiàn)型好等特點，可用于在線自動化柱前衍生，消除了手工操作中的錯誤，從而縮短反應(yīng)產(chǎn)物形成到熒光檢測之間的時間間隔，適合各種不同特性的生物樣品和小體積/小量的衍生化反應(yīng)，適用于農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究多胺的精確分析[20]。

2 NDA

NDA與胍丁胺在氰化物存在下反應(yīng)簡單快速，且衍生產(chǎn)物非常穩(wěn)定，見圖2。ROBERTS等[14]利用NDA柱前衍生HPLC熒光法測定小鼠脊髓給予胍丁胺后的藥效學(xué)和藥代動力學(xué)研究，實驗中將組織提取物真空濃縮并懸浮于100 μL pH=9.4的硼酸鹽緩沖液中；加入NaCN(40 μL，0.025 mol/L)，然后加入甲醇配制的萘二甲醛(100 μL，0.05 mol/L)，在室溫下反應(yīng)20 min，取5～10 μL反應(yīng)混合溶液進(jìn)樣。CHEN等[21]通過NDA柱前衍生化毛細(xì)管電泳結(jié)合發(fā)光二極管誘導(dǎo)熒光檢測(CE-LEDIF)法分離啤酒樣品中的氨基酸和胺，檢測到胍丁胺濃度為87.4 μmol/L。另外，ZHAO等[15]認(rèn)為用NDA衍生胍丁胺其衍生產(chǎn)物對熱穩(wěn)定，且具有激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測有利的檢測波長(λex=447 nm，λem=520 nm)，但柱子對衍生物和過多的NDA保留極強(qiáng)，難以洗脫。

3 NBD-F

熒光標(biāo)記試劑NBD-F用于柱前衍生化，所得到的衍生產(chǎn)物具有高的光穩(wěn)定性和有利的最大激發(fā)波長(480 nm，接近氬離子激光發(fā)射器的激發(fā)波長488 nm)，因此可用激光誘導(dǎo)熒光檢測器(LIF)進(jìn)行檢測。ZHAO等[15]利用NBD-F作為柱前衍生化試劑結(jié)合LIF檢測鼠腦、胃組織及人血漿中胍丁胺的含量反應(yīng)方程見圖3，檢出限為5 nmol/L，檢測時間<10 min。研究中指出，NBD-F與胍丁胺的衍生化反應(yīng)需在一定溫度下進(jìn)行，如堿性環(huán)境下(pH=8.5)、溫度T=60 ℃時，反應(yīng)時間為40 min。室溫條件下該衍生產(chǎn)物存放2 h仍保持穩(wěn)定，經(jīng)乙酸乙酯萃取后，于4 ℃冰箱可穩(wěn)定保存數(shù)月。另外，文獻(xiàn)中提到，NBD-F的濃度直接影響衍生物產(chǎn)量，當(dāng)NBD-F與胍丁胺的比例大于120∶1時，熒光信號最大。用NBD-F衍生胍丁胺的有效pH范圍為8.3～9.5，在溶液pH>9.5時，NBD-F將會發(fā)生明顯的水解反應(yīng)，從而導(dǎo)致色譜峰拖尾嚴(yán)重。PAULSON等[22]采用超高效液相-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-ESI-MS)，以NBD-F作為柱前衍生試劑測定肺囊性纖維化患者痰樣本中胍丁胺的含量，其檢測限為40 nmol/L?？傊?，NBD-F衍生胍丁胺反應(yīng)穩(wěn)定，且熒光強(qiáng)度適宜，靈敏度高，可用于精確定性定量分析。但是由于該方法需要LIF或質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測，一般實驗室無法普及。

圖2 胍丁胺與NDA類衍生試劑的反應(yīng)方程式

圖3 胍丁胺與NBD-F的反應(yīng)方程式

4 FMOC-Cl

FMOC-Cl能與伯胺、仲胺在介質(zhì)pH 8.5～9.5發(fā)生反應(yīng)，該衍生過程速度快、產(chǎn)物穩(wěn)定、熒光強(qiáng)度高、靈敏度高，是一種較為理想的氨基酸定量分析的柱前衍生化試劑。BAUZA等[16]利用FMOC-Cl柱前衍生HPLC法測定白葡萄酒中5種氨基酸和8種胺類物質(zhì)的含量，在20 μL白葡萄酒樣品中加入50 μL緩沖溶液(pH=8.5)和100 μL FMOC試劑(8 mg FMOC/1 mL ACN)反應(yīng)3 min后，加入300 μL淬滅劑(乙腈-乙酸-水，比例為20∶2∶3)。該方法檢測得到胍丁胺的含量為4.1 mg/L。然而，F(xiàn)MOC衍生有一個眾所周知的缺點，即寬試劑峰[FMOC-Cl和(或)FMOC-OH]的干擾效應(yīng)。為了消除寬試劑峰的干擾，KIRSCHBAUM等[23]對衍生試劑用量、淬滅試劑最佳需要量及定量反應(yīng)的最佳時間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，衍生過程中高濃度的FMOC-Cl衍生試劑和過量的淬滅試劑沒有辦法定量消除，氨基酸與FMOC-Cl的最佳反應(yīng)時間為3 min，而對于具有較低反應(yīng)速率的胺最佳反應(yīng)時間為5 min。

5 AA

胍丁胺由于結(jié)構(gòu)中沒有吸收基團(tuán)，難以氣化，較難檢測。丘忠麗等[17]以HFAA作為胍丁胺的衍生試劑，采用同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜法檢測大鼠血漿中的內(nèi)源性胍丁胺，檢出限為0.005 7 ng/mL。與同類衍生試劑AA、TFAA相比，HFAA衍生胍丁胺產(chǎn)率更高，且衍生產(chǎn)物最穩(wěn)定、揮發(fā)度高(氣化溫度降低)，從而促進(jìn)了胍丁胺在氣相色譜(GC)上獲得較好的分離和檢測。DOUGLAS等[24]利用該反應(yīng)產(chǎn)物成環(huán)具有高度揮發(fā)性和良好的電捕獲能力，通過負(fù)化學(xué)電離質(zhì)譜(GC-NCI-MS)檢測鼠腦組織中的胍丁胺，保留時間為2 min，檢出限為25 fmol/L。但是該方法樣品前處理較為復(fù)雜，需經(jīng)過2次液液萃取。另外,阮志鵬[25]應(yīng)用HFAA作衍生試劑，乙酸乙酯作催化劑，通過氣相色譜氮磷檢測器(GC-NPD)分析大鼠血漿中的胍丁胺濃度，其最低檢測濃度為0.1 μg/mL，可用于胍丁胺的血藥濃度分析及藥代動力學(xué)研究。

6 小 結(jié)

隨著內(nèi)源性胍丁胺的生物學(xué)作用日益被廣泛關(guān)注，以及外源性胍丁胺可能具有良好的新藥開發(fā)前景和價值，胍丁胺衍生化高特異度與靈敏度的定量檢測方法的建立成為眾多研究者關(guān)注的重點。分析發(fā)現(xiàn)，各衍生試劑與胍丁胺反應(yīng)的條件不同，生成的化合物穩(wěn)定性、熒光強(qiáng)度亦有明顯差異，筆者總結(jié)了幾種常用的衍生試劑與胍丁胺發(fā)生衍生反應(yīng)的條件，見表1。

表1 不同衍生試劑與胍丁胺衍生的條件

注：-表示無此項

目前，柱前衍生化色譜/質(zhì)譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于樣品中胍丁胺的檢測，常用衍生試劑包括OPA、NDA、NBD-F、FMOC-Cl等。OPA類衍生試劑與胍丁胺反應(yīng)快速、簡單，過量的衍生試劑對檢測不產(chǎn)生干擾，衍生產(chǎn)物具有高度熒光。但是該類衍生試劑不與次級氨基酸發(fā)生反應(yīng)；衍生試劑不穩(wěn)定，通常只能保存1～2 d，臨用時須新鮮配制；衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性相對較差，限制了樣品預(yù)處理程序的使用，如樣品清潔和預(yù)濃縮。NDA與伯胺在氰化物存在下反應(yīng)簡單快速，且衍生產(chǎn)物非常穩(wěn)定，但柱子對衍生物和過多的NDA保留極強(qiáng)，難以洗脫。NBD-F與胍丁胺反應(yīng)衍生產(chǎn)物較單一，雜質(zhì)干擾少，具有極佳的光穩(wěn)定性。當(dāng)溶液pH>9.5時，NBD-F將會發(fā)生明顯的水解反應(yīng)，導(dǎo)致色譜峰嚴(yán)重拖尾，所以需嚴(yán)格控制溶液的pH。FMOC-Cl能與伯胺和仲胺發(fā)生快速反應(yīng)，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，熒光強(qiáng)度高，靈敏度高。然而，F(xiàn)MOC-Cl不僅和氨基酸會發(fā)生多重衍生反應(yīng)，而且易形成寬試劑峰干擾氨基酸分離，衍生過程中高濃度的FMOC-Cl和過量的淬滅試劑較難定量消除。HFAA與胍丁胺反應(yīng)衍生物產(chǎn)率高、易揮發(fā)且穩(wěn)定，但反應(yīng)條件苛刻，需要較高溫度和較長時間。在實際胍丁胺測定過程中選擇衍生試劑需要根據(jù)自身試驗需要，綜合考慮衍生試劑是否容易獲得、穩(wěn)定性、衍生反應(yīng)的快慢以及衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性、靈敏度、檢測限等。只有充分了解這些衍生試劑的特點，才能做出正確的選擇，從而獲得理想的測定結(jié)果。