心復康口服液干預心力衰竭大鼠心肌線粒體蛋白質組學研究＊

李琪琳，胡元會，吳華芹，王 歡，孫 偉，王輝奇

（1.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院 北京 100102；2.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院 北京 100053）

心力衰竭是一組常見的臨床綜合征，是大多數(shù)心血管疾病發(fā)展的最終歸宿。隨著現(xiàn)代人口老齡化進程的加快和高血壓、冠心病等發(fā)病人數(shù)增多，心力衰竭發(fā)病率和病死率逐年上升，已成為人類健康的重大挑戰(zhàn)之一[1]。心復康口服液是我們臨床治療心力衰竭的經(jīng)驗方，該方由黃芪、人參、丹參、靈芝、紅花、淫羊藿、附子等中藥組成，具有益氣溫陽、活血化瘀之功效。多年的臨床和實驗研究表明，心復康口服液可保護心肌缺血性損害，改善臨床癥狀和心功能，提高患者的生活質量[2，3]。線粒體蛋白質組學是研究線粒體在生理、病理過程中的功能變化及其與疾病發(fā)生發(fā)展關系和機制的重要方法，目前已越來越受到醫(yī)學界的重視和廣泛關注。本實驗采用雙向凝膠電泳和基質輔助激光解吸離子質譜技術，以心肌線粒體為切入點，研究心復康口服液對心力衰竭大鼠心肌線粒體蛋白質組學的影響，探討其可能的作用機制，從而為心力衰竭的早期診斷、尋找新的治療靶點提供思路。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

正常雄性SD大鼠30只（體質量200±20 g），購自北京維通利華實驗動物有限公司（許可證號：SCXK(京)2012-0001），分籠飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院SPF級動物房。

表1 等點聚焦程序設置

1.2 主要儀器

彩色多普勒超聲顯像儀（型號：HP5500，美國PHILIPS公司）；動物呼吸機（型號：HX-300S，成都泰盟科技有限公司）；多功能電泳系統(tǒng)（型號：MultiphorⅡ，美國Amersham公司）；垂直電泳槽（型號：ProteanⅡXi cell，美國Bio-Rad公司）；膠圖掃描儀（型號：Power Look 2100XL，美國UMAX公司）；質譜儀（型號：4700 MALDITOF/TOF，美國AB SCIEX公司）；凝膠分析軟件（型號：Imagemaster2D，美國Amersham Biosciense公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（型號：Gel Doc XR+，美國Bio-Rad公司）。

1.3 主要試劑

固相PH梯度干膠條（pH=3-10，L=18 cm）、IPG緩沖液（pH=3-10，美國Bio-Rad公司）；CHAPS、溴酚藍、乙二胺四乙酸均購自美國Sigma公司；十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、瓊脂糖均購自美國Promega公司；考馬斯亮藍、標準蛋白標志物均購自美國Amersham pharmacia公司；乙腈、胰蛋白酶、甘氨酸均購自美國Fisher公司；轉印膜（美國Millipore公司）；無水醋酸鈉、無水碳酸鈉、戊二醛、乙醇、冰醋酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.4 藥物

心復康口服液（主要成分為黃芪、人參、丹參、靈芝、紅花、淫羊藿、附子等，批號：20120312）。

1.5 抗體

一抗：Anti-GRP75 antibody、Anti-ATP5A antibody、Anti-Nucleophosmin antibody均購自美國Abcam公司；二抗：羊抗小鼠、羊抗兔購自北京中杉金橋公司。

2 方法

2.1 動物模型

參照Pfeffer[2]報導的方法，結扎冠狀動脈左前降支，制備心肌死后心衰大鼠模型，術后連續(xù)3天注射20萬單位青霉素以抗感染。假手術組制備：僅在冠狀動脈前降支起始點下約2-3 mm穿線而末結扎前降支，余步驟與動物模型制備方法相同。

2.2 實驗分組及給藥

分組：動物購回后喂養(yǎng)標準合成飼料，適應性喂養(yǎng)5天，禁食12 h后，以體重均衡，隨機分為假手術組與造模組，假手術組8只，造模組22只。造模組大鼠按動物模型復制方法所述方法造模，術后第2周對模型大鼠行超聲心動檢測，以EF減損＞15%為入選模型組標準。將入選模型大鼠隨機分為模型組、心復康口服液組，每組大鼠不少于6只。給藥；①假手術組：生理鹽水4.0 mL·kg-1灌胃；②模型組：生理鹽水4.0 mL·kg-1灌胃；③Xinfukang口服液組：5.4 g·kg-1溶于生理鹽水灌胃。大鼠于分組后開始灌胃給藥，連續(xù)給藥8周，每天1次。

2.3 心肌線粒體分離

采用差數(shù)離心法提取心肌線粒體。造模后第8周末，將大鼠麻醉后，開胸迅速取出心臟。PBS緩沖液反復洗凈心臟，稱取100 mg心肌，加入1.5 mL勻漿介質，冰浴勻漿。4℃1 300 r·min-1離心15 min，保留上清，重復該步驟2次；取上清液于另一干凈離心管中，4℃17 000 r·min-1離心15 min，棄上清，沉淀用0.2 mL勻漿介質懸浮，重復該步驟2次，棄上清，所得沉淀即為線粒體。

2.4 線粒體蛋白提取

于上述心肌線粒體樣品中加入1 mL裂解液，渦旋振蕩破碎，冰浴中靜置4 min以上，使蛋白樣品盡量溶解；4℃ 40 000 r·min-1離心1 h，棄沉淀，上清液即為提取的線粒體蛋白。采用Bradford法測蛋白含量，-80℃保存。

2.5 雙向凝膠電泳

取蛋白樣品0.8 mg，加泡脹緩沖液稀釋至350 μL，充分混勻；在泡脹盤泡脹槽一側加入上述樣品混合液，將膠條放入泡脹盤，水化12 h。水化完畢后，將膠條取出，于等點聚焦儀內(nèi)聚焦電泳，溫度設置為20℃（表1）。聚焦結束，將膠條取出，在平衡液I中平衡15 min，然后換平衡液II中平衡15 min。將平衡后的膠條放到SDS-PAGE凝膠上端，用0.5%的瓊脂糖封嚴，并將膠板固定于電泳槽內(nèi)。加入電泳緩沖液，接通電源，直至溴酚藍前沿距離凝膠底0.5 cm時停止電泳。每次同時運行3個蛋白樣品，每個蛋白樣品重復雙向電泳3次，以確保結果的可重復性。電泳結束后，行考馬斯亮藍染色。

圖1 雙向凝膠電泳圖

2.6 圖像掃描與分析

染色后的凝膠通過UMAX PowerLook 2100XL掃描儀透射掃描獲取圖像。掃描完后，采用Imagemaster2D Platinum 5.0軟件對膠圖依次進行蛋白點的檢測、背景扣除、匹配、標準化及人工校對處理，尋找差異表達的蛋白質點。

2.7 差異蛋白質點的膠內(nèi)酶解

沿斑點染色邊緣將差異蛋白點切下，用NH4HCO3溶液脫色30 min，重復2-3次。脫色后的膠塊離心干燥20 min。干燥后加入6 mL胰蛋白酶液，4℃放置30 min，再加入20 mL胰酶覆蓋液，置于37℃水浴箱酶解20 h。在膠塊內(nèi)加入15 μL 5%TFA，37℃溫育30 min，吸取上清，然后加入15 μL 5%TFA/50%ACN，37℃溫育30 min，吸取上清與上一次吸取液合并，再加入15 μL 100%ACN，室溫靜置5 min，吸取上清與上兩次吸取液合并，離心干燥。用3 μL含0.5%TFA溶液溶解干燥好的肽段，即可用于質譜分析。

2.8 質譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索

采用AB 4700型MALDI-TOF/TOF質譜儀進行質譜檢測。設定胰蛋白酶自切峰（MH+:2163.05Da）作為內(nèi)標進行校正，用l mL標準品與基質混合肽作為外標進行校正，獲得相應的肽質量指紋圖（PMF）。根據(jù)質荷比（M/Z）通過Mascot軟件在線檢索SwissProt蛋白數(shù)據(jù)庫（http://www.matrixscience.com）以確定鑒定結果。

2.9 Western blot驗證

采用差數(shù)離心法提取大鼠心肌線粒體蛋白。取蛋白樣品50 μg，加入等體積樣品緩沖液，混勻，100℃變性5 min；12%SDS-PAGE電泳，結束后半干轉至PVDF膜。搖床上封閉2 h；雜交一抗，4℃過夜，洗膜，雜交二抗，室溫搖床上2 h，洗膜。用ECL發(fā)光劑浸膜5 min，取出后置曝光匣中曝光。掃描曝光片后，應用Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)分析底片的目的條帶。

2.10 統(tǒng)計分析

實驗獲得的各計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示。模型組與假手術組、給藥組與模型組灰度值相比大于2或小于0.5的蛋白點定義為差異蛋白點，其中大于2為表達上調，小于0.5為表達下調。PMF圖譜分析以Mascot Score得分＞55為鑒定成功蛋白。

3 結果

3.1 雙向凝膠電泳結果分析

各組雙向凝膠電泳圖譜如圖1所示。圖像經(jīng)Imagemaster軟件分析，假手術組可分辨蛋白點為698±35，模型組為712±42，心復康口服液組為677±52，雙向電泳各組重復3次，每組分別將其中的一塊分辨率高、質量好的凝膠定為參考膠，進行組內(nèi)3塊膠間的蛋白質點匹配，發(fā)現(xiàn)樣品重復性好，制備穩(wěn)定，可用于差異蛋白質點的分析。

3.2 差異蛋白點質譜鑒定結果

圖2 459號點PMF圖

表2 13個鑒定成功蛋白

模型組與假手術組相比有差異而心復康口服液可使差異趨勢逆轉的蛋白點為20個，對這20個蛋白點進行了MALDI-TOF-MS分析，獲得20張PMF圖譜（圖2為459號點PMF圖），PMF圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)SwissProt數(shù)據(jù)庫檢索，成功鑒定出13個蛋白（表2）。其中心復康口服液上調的蛋白為鳥氨酸轉氨酶（Ornithine aminotransferase）、谷胱甘肽S-轉移酶P（Glutathione S-transferase P）、谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase）、3-磷酸甘油脫氫酶（Glycerol-3-phosphate dehydrogenase）、ATP合成酶α亞基(ATP synthase subunit alpha)、磷酸丙糖異構酶（Triosephosphate isomerase）、α-烯醇酶（Alpha-enolase）、丙酮酸激酶同工酶M1/M2(Pyruvate kinase isozymes M1/M2)，下調的蛋白為線粒體應激蛋白70（Stress-70 protein）、微管蛋白β-5(Tubulin beta-5)、葡萄糖調節(jié)蛋白78（78 kDa glucose-regulated protein）、核仁磷酸蛋白（Nucleophosmin）、核內(nèi)不均一核糖核蛋白 A2/B1（Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1）。根據(jù)功能分類和生物學分析，這13個蛋白主要與能量代謝、應激反應、氧化損傷、細胞骨架、細胞分化增殖等功能相關。

3.3 部分差異蛋白回復性驗證結果

與假手術組相比，模型組Stress-70、Nucleophosmin表達明顯升高，ATP-α表達明顯降低；與模型組相比，心復康口服液組Stress-70、Nucleophosmin表達明顯降低，ATP-α表達明顯升高（圖3）。

4 討論

心力衰竭是各種心臟病的終末階段，其高患病率和高死亡率已儼然成為人類共同面對的一個公共健康問題。研究發(fā)現(xiàn)，無論心衰的基礎原因是血流動力學異常、神經(jīng)體液激素過度激活、功能性心肌喪失還是瓣膜異常等，均伴有線粒體結構和功能的改變[5-7]。因此，深入線粒體蛋白質組學研究對闡明心衰病理生理機制、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點具有舉足輕重的意義。

中醫(yī)認為心力衰竭的基本病機為氣虛陽虧、血瘀水停，以益氣溫陽、活血利水為其主要治法。心復康口服液是我們臨床治療氣虛血瘀型心衰經(jīng)驗方，該方由黃芪、人參、淫羊藿、靈芝、丹參、當歸、川芎等中藥組成，組方以益氣溫陽、活血化瘀為主，兼有利水消腫之功。既往實驗研究中，通過建立不同動物模型，證實了心復康口服液對各種心肌損傷及心力衰竭模型具有鈣拮抗、保護缺血心肌等藥理作用，為其臨床治療心力衰竭提供了切實依據(jù)[8]。

本實驗結果表明，模型組與假手術組相比有差異而心復康口服液可使差異趨勢逆轉的蛋白點共有20個，經(jīng)質譜分析成功鑒定出13個蛋白，其中7個與能量代謝相關，2個與應激反應相關，1個與氧化損傷相關，1個與細胞骨架相關，2個與細胞分裂增殖相關。具體分述如下：

4.1 與能量代謝相關蛋白

心力衰竭時，心肌缺血缺氧，心肌能量代謝模式發(fā)生改變，表現(xiàn)為脂肪酸有氧氧化降低，氧化磷酸化減弱，葡萄糖無氧酵解增強，ATP生成總量明顯下降[9，10]。本實驗結果顯示，與假手術組比較，模型組參與氧化磷酸化的關鍵酶ATP-α亞基表達下調，經(jīng)過心復康口服液治療后ATP-α亞基表達上調，說明心復康口服液可使受損心肌氧化磷酸化得到保護，在一定程度上糾正心肌能量代謝障礙。既往研究也證實，心復康口服液可上調心肌梗死后心衰大鼠心肌細胞GLUT1mRNA表達，增加心肌組織中ATP含量[11，12]，這與本研究結果有類似之處。同時，我們也發(fā)現(xiàn)參與糖酵解的關鍵酶丙酮酸激酶同工酶M1/M2、3-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、α-烯醇酶在中藥組表達上調，考慮其原因可能是心復康口服液一定程度上增強了心肌細胞糖酵解作用，以代償性彌補ATP生成不足。

此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)中藥組鳥氨酸轉氨酶和谷氨酸脫氫酶表達上調，說明心復康口服液可調節(jié)模型動物氨基酸代謝失衡，并最終改善心肌能量代謝。

圖3 Western blot驗證結果

4.2 與應激反應相關蛋白

結扎冠狀動脈致心梗后心衰，可誘導心肌細胞發(fā)生內(nèi)質網(wǎng)應激(ERS)，介導細胞凋亡，加速心衰的發(fā)生發(fā)展[13，14]。應激蛋白70家族又名熱休克蛋白70家族（HSP70），在防止應激引起的細胞損害或修復受損細胞方面發(fā)揮著重要作用。有研究示，HSP70血漿濃度越高，心力衰竭越嚴重[15]。葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）屬HSP70家族，目前國內(nèi)外學者一致認為GRP78表達上調是ERS反應的開始[16，17]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，模型組應激蛋白70、GRP78較假手術組表達上調，中藥干預后兩者表達下調，提示心復康口服液可減輕模型動物出現(xiàn)的應激反應，使受損心肌得到保護，但其作用機理有待明確。

4.3 與氧化損傷相關蛋白

研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭動物模型中氧自由基明顯增加，抗氧化系統(tǒng)受損，過多的活性氧產(chǎn)生導致鈣超載。當氧自由基生成過多或抗氧自由基物質活性降低，引起氧自由基堆積，導致氧化損傷[18]。谷胱甘肽轉移酶(GST)是谷胱甘肽結合反應的關鍵酶，具有清除自由基、抗氧化的作用。GSTP是GST家族中的成員之一，本實驗中，模型組GSTP表達下調，經(jīng)中藥治療后表達上調，表明心復康口服液可減輕模型動物氧化損傷，提高心肌抗氧化能力，推測其機理可能與心復康口服液通過增加GSTP的表達，間接性的起到清除自由基作用有關。

4.4 與細胞骨架相關蛋白

微管蛋白是細胞骨架的重要組成成分。研究發(fā)現(xiàn)，微管蛋白在缺血缺氧后10 min即可出現(xiàn)明顯改變，2 h內(nèi)幾乎已經(jīng)完全破壞，表現(xiàn)為絲狀結構的破壞及熒光強度的減弱[19，20]。本實驗結果表明，經(jīng)心復康口服液治療后，模型組上調的微管蛋白β-5出現(xiàn)下調，提示心復康口服液在一定程度上可保護細胞骨架免于受損裂解。此前，有學者應用電鏡硝酸鑭電子示蹤技術證實了心復康口服液能夠保護心肌細胞的超微結構，減輕心肌膜通透性改變[21]，這與本實驗結果相吻合。

4.5 與細胞分化增殖相關蛋白

核內(nèi)不均一核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2/B1)是一種重要的RNA連接蛋白，與細胞有絲分裂、成熟、分化及凋亡的調節(jié)相關。核仁磷酸蛋白（NPM）是一種多功能核仁磷酸化蛋白，參與核糖體前體運輸和合成、中心體的復制、有絲分裂、DNA修補以及應激反應等生命活動，進而調控細胞的增殖發(fā)育等。研究發(fā)現(xiàn)，以上兩種蛋白與腫瘤等增殖性疾病的發(fā)病密切相關[22，23]，但與心血管疾病關系鮮有報道。本實驗結果顯示，模型組hnRNPA2/B1和NPM表達均上調，中藥組兩者均下調，推測心復康口服液可能參與了調節(jié)心肌細胞分化增殖、減緩細胞凋亡、修復損傷心肌，但其具體作用機制有待進一步研究。

本實驗采用Western blot技術，從蛋白水平驗證線粒體Stress-70、ATP-α、Nucleophosmin在各組的表達水平，實驗結果表明，模型組Stress-70、NPM表達上調，ATP-α表達下調，心復康口服液組Stress-70、NPM表達下調，ATP-α表達上調。此結果與蛋白質組學變化趨勢一致，提示采用雙向凝膠電泳和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術，以心肌線粒體為切入點，研究心復康口服液對心衰大鼠心肌線粒體蛋白質組學的影響，結果真實可靠。