超高效液相色譜-三重四極桿質譜法測定血漿和尿液中馬桑亭和馬桑寧

張秀堯, 蔡欣欣, 張曉藝, 李瑞芬

(溫州市疾病預防控制中心, 浙江 溫州 325001)

馬桑(Coriaria sinica Maxim)是馬?？岂R桑屬植物,主要分布于我國西北、西南等地,全株有毒,尤以未成熟的果實毒性最大,馬桑果為豌豆大小,未成熟時為綠色,成熟時由鮮紅色漸變?yōu)樽虾谏?外形酷似桑葚,味微甜,常被兒童采食引起中毒,人誤食馬桑青果15～60 g即可中毒[1-5]。同時,馬桑屬植物又是新西蘭廣泛分布的有毒原生植物,若蜜蜂采集到以馬桑汁液為生的澳洲廣翅蠟蟬(Scolypopa australis)所分泌的蜜露,則蜂蜜可能有毒,從而可能會引起食用者中毒[6-9]。馬桑的毒性成分主要有馬桑內酯(馬桑毒素,coriamyrtin)、羥基馬桑內酯(吐丁內酯,tutin)、馬桑亭(coriatin)、馬桑寧(corianin)等倍半萜內酯類化合物[10,11],化學結構見圖1。馬桑內酯和羥基馬桑內酯等為γ-氨基丁酸(GABA)受體拮抗劑,小鼠皮下注射馬桑根煎劑、葉煎劑、莖煎劑的半數(shù)致死量(LD50)分別為25 g/kg、9.75 g/kg和20 g/kg[2],羥基馬桑內酯的LD50為3.2 mg/kg(bw)[8]。馬桑中毒潛伏期為0.5～3 h,輕者會有惡心、嘔吐、胸悶、腹部不適、頭昏和嗜睡等癥狀,可自行恢復;重者則反復嘔吐、頭暈、心悸、全身發(fā)麻、突然昏迷而進入抽搐期,嚴重者呼吸衰竭而死亡[12]。因此,迫切需要建立一種快速確定馬桑中毒的檢測方法。

圖 1 馬桑內酯、羥基馬桑內酯、馬桑亭和馬桑寧的化學結構Fig. 1 Chemical structures of coriamyrtin, tutin, coriatin and corianin

馬桑內酯類化合物的檢測方法報道較少,早期報道的薄層色譜掃描法主要適用于生藥及注射液中有效成分的測定[13],近年來殷耀等[14]采用超高效液相色譜-高分辨質譜聯(lián)用法在電噴霧電離(ESI)負離子模式下測定蜂蜜中的馬桑亭、馬桑寧和羥基馬桑內酯,檢出限為0.05 mg/kg,定量限為0.1 mg/kg。Fields等[8]采用丙酮-水溶液提取、二氯甲烷-正己烷萃取、硅膠固相萃取柱凈化,超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用法在大氣壓化學電離(APCI)正離子模式下測定人血清中羥基馬桑內酯,采用大體積進樣(100 μL),檢出限達0.1 ng/mL。目前有關血漿和尿液中馬桑亭和馬桑寧的檢測方法未見公開報道。本文選用馬桑亭和馬桑寧作為馬桑中毒的標志物,采用固相支持液液萃取法提取和凈化樣品,超高效反相液相色譜分離,三重四極桿質譜法檢測,內標法定量,方法快速、靈敏、準確。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀(包括ACQUITY UPLC BSM二元溶劑管理系統(tǒng)、ACQUITY UPLC FTN樣品管理系統(tǒng)、ACQUITY UPLC CM-A色譜柱管理系統(tǒng)和Empower 3工作站,美國Waters公司); QTRAP 6500三重四極桿/線性離子阱復合質譜儀(Analyst 1.6.2軟件,美國AB SCIEX公司); MS3旋渦混旋器(德國IKA-WERKE公司); 24孔N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司); Gradient A10 Milli-Q超純水器(法國Millipore公司)。

甲醇、乙腈和叔丁基甲醚(液相色譜溶劑級,德國Merck公司),乙酸乙酯(液相色譜溶劑級,美國Tedia公司)。Cleanert SLE固相支持液液萃取柱(200 mg/3 mL,天津博納艾杰爾科技有限公司),親水聚四氟乙烯濾膜針式過濾器(直徑13 mm,孔徑0.22 μm,上海安譜實驗科技股份有限公司)。羥基馬桑內酯、馬桑亭和馬桑寧標準物質(純度≥98%,云南西力生物技術公司),氟苯尼考標準物質(純度≥98%,德國Dr. Ehrenstorfer公司),溶于甲醇制成100 mg/L的標準物質儲備液,臨用時用甲醇稀釋至所需濃度的混合標準溶液,-35 ℃保存。健康人血漿購自溫州市中心血站,尿液由健康人提供。

1.2 樣品前處理

吸取1.00 mL血漿或尿液于2 mL Eppendrof管中,加入10 μL 0.10 mg/L氟苯尼考內標標準溶液和200 μL 1%(v/v)氨水溶液,混勻,待凈化。

吸取200 μL上述試液加至Cleanert SLE固相支持液液萃取柱中,待試液進入填料后靜置5 min以上,用4.0 mL叔丁基甲醚洗脫(流速1～2 mL/min),收集洗脫液,于50 ℃氮氣吹干,加入200 μL 15%(v/v)甲醇水溶液,渦旋15 s,過0.22 μm濾膜,待測。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件

Cortecs C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.6 μm)和Cortecs C18保護柱(5 mm×2.1 mm, 1.6 μm) (美國Waters公司)。流動相A:甲醇;流動相B:水。梯度洗脫程序:0～3.50 min, 15%A～54%A; 3.50～3.60 min, 54%A～95%A; 3.60～5.50 min, 95%A; 5.50～5.60 min, 95%A～15%A; 5.60～7.50 min, 15%A;流速:0.250 mL/min;柱溫45 ℃;進樣體積10 μL。乙腈作為清洗溶劑(Wash solvent), 15%(v/v)甲醇溶液作為消除溶劑(Purge solvent)。

1.3.2質譜條件

電噴霧離子源負離子多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測。離子化電壓(IS): -4 500 V,離子源溫度(TEM): 350 ℃,氣簾氣(CUR)壓強:277 kPa(40 psi),噴霧氣(GS1)壓強:345 kPa(50 psi),輔助加熱氣壓強(GS2): 345 kPa(50 psi),碰撞器(CAD): Medium。其他參數(shù)見表1。

表 1 馬桑亭、馬桑寧及內標物氟苯尼考的質譜參數(shù)

DP: declustering potential; CE: collision energy. * Quantitative ion.

運行開始時,色譜柱流出液經(jīng)六通切換閥切換至廢液直到2.40 min,六通切換閥將柱流出液切換到質譜離子源中,質譜同時采集數(shù)據(jù)直到3.10 min,六通切換閥又將柱流出液切回至廢液中。

本次調查的低年資手術室護士共49人，男16例（32.7%），女33例（67.3%）；年齡25歲以下9人（18.37%）、25～29歲35人（71.43%）、30～34歲5人（10.2%）；護士30人（61.2%），護師19人（38.8%）；教育程度：中專7人（14.3%），大專24人（49.0%），本科及以上18人（36.7%）；正式在編護士6人（12.2%）、合同聘用護士43人（87.8%）；已婚22人（44.9%）、未婚27人（55.1%）。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優(yōu)化

分別在電噴霧和大氣壓化學電離正負離子電離方式下對羥基馬桑內酯、馬桑亭和馬桑寧的質譜測定條件進行優(yōu)化,在以上4種電離模式下,羥基馬桑內酯的響應值均很低,不適用于生物樣品的低濃度測定。在電噴霧和大氣壓化學電離負離子電離模式下,馬桑亭和馬桑寧均有一定的響應,且在電噴霧負離子電離模式下的響應更高,約為大氣壓化學電離的30倍,故后續(xù)試驗在電噴霧負離子電離模式下進行優(yōu)化。第1級四極桿全掃描時出現(xiàn)[M-H]-峰,以[M-H]-作為母離子進行碰撞解離,通過子離子掃描得到目標化合物的碎片離子信息,見圖2,然后再對去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化,使得分子離子對的信號達到最高。每種待測物選擇響應最高的兩對分子離子對,以其中響應高的分子離子對作為定量離子對,另一分子離子對作為定性離子對。再設定合適的峰駐留時間(dwell time)使得色譜峰的采樣點數(shù)在15～20之間,得到較好的定量重復性。優(yōu)化后的質譜條件見1.3.2節(jié)。

圖 2 馬桑亭和馬桑寧的子離子掃描譜圖Fig. 2 Product ion scan spectra of coriatin and corianin

2.2 超高效液相色譜條件優(yōu)化

試驗比較了100 mm×2.1 mm規(guī)格的BEH C18(1.7 μm)、HSS T3(1.8 μm)、Cortecs C18(1.6 μm)等色譜柱對馬桑亭和馬桑寧的分離效果,結果顯示Cortecs C18色譜柱的色譜響應和峰形均最佳,因此選為分析柱。考察了以甲醇-水、乙腈-水以及加入低濃度的甲酸、乙酸銨緩沖鹽和0.05%(v/v)氨水后的甲醇-水、乙腈-水作為流動相的分離效果,結果表明甲醇-水的響應值最高,故選為流動相。同時又對流動相梯度洗脫程序和柱溫等分離條件進行了優(yōu)化,最終使得待測物的色譜保留時間適當,優(yōu)化好的色譜條件見1.3.1節(jié)。馬桑亭和馬桑寧的化學結構非常相似,在本分離條件下無法達到分離,由于它們的分子離子對各不相同,并不影響在質譜上的檢測和定量。

2.3 內標物的選擇

采用內標法定量可以校正待測物在樣品前處理中的損失,可以校正質譜測定過程中的基質效應等,從而得到更好的準確度和精密度,最理想的是采用穩(wěn)定同位素內標法。由于目前馬桑亭和馬桑寧還沒有商品化的同位素內標,因此嘗試采用能在電噴霧負離子模式下電離的氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素作為內標物,結果顯示氟苯尼考的保留時間為2.74 min,與馬桑亭2.76 min和馬桑寧2.80 min相近,最終選用氟苯尼考作為內標物,可以校正質譜檢測時的波動性、樣品前處理過程中的損失和基質效應等。

2.4 樣品前處理方法優(yōu)化

固相支持液液萃取法(solid supported liquid/liquid extraction, SLE)采用多孔結構的硅藻土作為載體材料,當含水量高的血漿或尿液樣品上樣后,樣品被吸附于硅藻土微孔表面形成液膜,加入與水不互溶的洗脫溶劑時,洗脫溶劑進入硅藻土微孔內與水性的液膜進行微觀的液液萃取,待測物被洗脫溶劑從樣品液中萃取出來,而磷脂、蛋白質等雜質則留在硅藻土吸附的樣品液中,達到待測物同時提取和凈化的目的。其操作簡便快速,是一種高通量的樣品處理方法,已應用于生物樣品的前處理[15]。

馬桑亭和馬桑寧屬倍半萜內酯類物質,為脂溶性化合物,適合于固相支持液液萃取法提取和凈化,試驗選用乙酸乙酯和叔丁基甲醚作為洗脫溶劑進行比較,叔丁基甲醚在提取回收率、基質效應、基線噪聲和基質干擾等方面均優(yōu)于乙酸乙酯,最終選作洗脫溶劑;在各3份1.0 mL尿液和血漿中分別加入0.2 mL 3%(v/v)高氯酸、水和1%(v/v)氨水,代表酸性、中性和堿性條件進行試驗,結果顯示在堿性條件下,基質干擾和基質效應小、基線噪聲低,可能是在堿性條件下,尿液中大量酸性代謝成分未被萃取,試驗最終選擇在堿性條件下以叔丁基甲醚進行洗脫。

在空白血漿和尿液的處理殘渣中,加入200 μL 1.0 μg/L馬桑亭和10.0 μg/L馬桑寧的混合標準溶液制成基質標準溶液,基質效應(matrix effect, ME)通過基質標準溶液和溶劑標準溶液中待測物色譜峰面積的比值進行評估[16],平行試驗5次,結果顯示血漿中馬桑亭和馬桑寧的平均基質效應分別為98.6%(RSD為5.2%)和84.6%(RSD為5.8%),尿液中平均基質效應分別為78.1%(RSD為5.9%)和76.4%(RSD為6.1%),顯示有一定的基質效應;提取回收率通過加標樣品處理液和基質標準溶液中待測物色譜峰面積的比值進行評估[16],平行試驗5次,血漿中馬桑亭和馬桑寧的平均提取回收率分別為71.2%(RSD為5.1%)和73.7%(RSD為5.9%),尿液中分別為68.7% (RSD為6.1%)和78.0%(RSD為5.8%)。以上試驗顯示在測定過程中馬桑亭和馬桑寧存在一定的基質效應,且平均提取回收率在68.7%～78.0%之間,提示不能采用純溶劑標準溶液或用基質溶液作為溶劑配制的標準溶液進行定量,應采用基質工作曲線法進行定量,即在樣品中加入標準溶液系列，按樣品前處理方法制備再測定得到的工作曲線,期望能夠補償馬桑亭和馬桑寧在樣品處理時的損失和基質抑制效應。

2.5 方法的線性范圍、檢出限和定量限

分別在6份空白血漿樣品和6份空白尿液樣品中加入適量馬桑亭和馬桑寧混合標準溶液,使馬桑亭的質量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/L,馬桑寧的質量濃度分別為1、2、5、10、50、100 μg/L(各含有1.0 μg/L氟苯尼考標準溶液),按1.2節(jié)進行樣品前處理后再測定,采用MultiQuant定量軟件進行數(shù)據(jù)處理,以定量離子對與內標物的峰面積比值(Y)對標準溶液的質量濃度(X, μg/L)進行回歸(權重取1/X),結果見表2,相關系數(shù)均優(yōu)于0.996,線性關系良好。

在空白血漿和尿液樣品中分別加入低濃度的馬桑亭和馬桑寧進行測定,以分子離子對的信噪比≥3時的樣品濃度作為檢出限(LOD),以信噪比≥10時的樣品濃度作為定量限(LOQ),測得血漿和尿液中馬桑亭和馬桑寧的檢出限和定量限見表2。定量限濃度水平加標的血漿樣品的色譜圖見圖3。

2.6 樣品的加標回收和精密度試驗

在空白血漿和尿液樣品中分別添加4個質量濃度水平的馬桑亭和馬桑寧標準溶液,按1.2節(jié)進行樣品處理和測定,每個添加水平平行試驗6次,血漿和尿液中馬桑亭和馬桑寧的平均加標回收率為86.2%～110%,相對標準偏差為5.1%～14.6%(見表3),符合痕量分析的要求。

表 2 血漿及尿液基質中馬桑亭和馬桑寧的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

Y: peak area ratio of the quantitative ions of analyte to internal standard (weight 1/X);X: mass concentration, μg/L.

圖 3 空白血漿及血漿加標樣品中馬桑亭和馬桑寧的UPLC-MS/MS色譜圖Fig. 3 UPLC-MS/MS chromatograms of coriatin and corianin in a blank plasma and a plasma sample spiked with coriatin and corianin

CompoundMatrixSpiked level/(μg/L)Found/(μg/L)Recovery/%RSD/%Coriatinplasma0.030.03100.013.30.10.11110.09.41.00.9595.07.54.03.4586.25.4urine0.10.1100.013.70.50.5100.08.62.01.995.05.78.07.492.54.2Corianinplasma0.30.3100.012.51.01.1110.05.310.09.292.08.740.041.6104.05.1urine11.1110.014.65.05.1102.010.220.018.994.46.780.083.8104.87.9

3 結論

本文建立了測定血漿和尿液中馬桑中毒標志物馬桑亭和馬桑寧的超高效液相色譜-三重四極桿質譜檢測方法。采用固相支持液液萃取法處理樣品,簡化了操作步驟,通過對色譜分離和質譜檢測等條件的優(yōu)化,得到了較高的檢測靈敏度。方法學驗證結果表明,方法快速、簡便,靈敏度高,準確度和精密度好,可用于馬桑中毒的快速檢測。