全基因測序（WGS）在腸桿菌科細(xì)菌中的應(yīng)用研究

周子超，何嵐，丁月平

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310005；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院ICU，浙江 杭州 310005）

0 引言

全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）是通過新一代的生物信息技術(shù)，并結(jié)合新的模式識別方法和網(wǎng)絡(luò)分析，來分析不同機體基因組間的結(jié)構(gòu)差異手段來分析不同機體基因組間的結(jié)構(gòu)差異、單核苷酸的多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）和核心基因組多位點序列（core genome multilocus sequence typing，cgMLS）。具有信息全面、精確、高通量及高分辨率等優(yōu)點。且隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，測序成本的大幅降低，WGS檢測技術(shù)得以迅速普及，并快速超越傳統(tǒng)策略，成為當(dāng)前群體進化、變異分析和功能基因挖掘的最主要研究策略，在細(xì)菌流行病學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。

腸桿菌科細(xì)菌是臨床上常見的條件致病菌，可致肺炎、泌尿道感染、腹膜炎，菌血癥等疾病。隨著碳青霉烯類等抗菌藥物的廣泛和不合理應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性普遍增加，甚至出現(xiàn)了碳青霉烯類耐藥，顯著增加了臨床治療的難度，耐藥菌的流行。因此，全面監(jiān)測該類細(xì)菌的致病性、耐藥機制和臨床流行病學(xué)具有重要的意義。

本文將WGS在腸桿菌科細(xì)菌中的應(yīng)用作一綜述，以期為WGS在細(xì)菌流行病學(xué)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 全基因測序技術(shù)概況

全基因組測序技術(shù)現(xiàn)階段應(yīng)用主要包括第二代測序技術(shù)（NPS）和第三代測序技術(shù)。在第一代測序技術(shù)（Sanger法）成本和速度發(fā)展至極限卻依然無法大規(guī)模應(yīng)用的情況下，第二代測序法應(yīng)運而生。2005年，454 Life sciences公司（現(xiàn)被Roche公司收購）首次基于焦磷酸測序法，以“邊合成邊測序”為核心，“片段-磁珠-讀長”的形式，達成了“超高通量”——能同時測序幾十萬到幾百萬條DNA分子，由此開辟了第二代測序技術(shù)的先河。隨著科技的不斷創(chuàng)新，2011年，第三代測序技術(shù)以單分子熒光、納米孔及實時記錄為技術(shù)核心，在原有的化學(xué)的間接性檢測基礎(chǔ)上融入顯微鏡觀察的直接性實時物理檢測，測序效率提升了2萬倍；在直接檢測與讀長增長的雙重條件下，結(jié)合更為先進的設(shè)備與熒光技術(shù)，使得精確率高達99.9999%。

綜上可知，每一代測序技術(shù)所基于的檢測（標(biāo)記）技術(shù)各不相同，即每一代誕生均為質(zhì)的改變。三代測序技術(shù)在研究應(yīng)用中不斷發(fā)展，尤其是第三代測序技術(shù)，突破技術(shù)制約，使其在研究領(lǐng)域迅速普及，成為當(dāng)前細(xì)菌群體進化、變異分析和功能基因挖掘的最主要研究策略，并在細(xì)菌流行病學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。

2 WGS在腸桿菌科細(xì)菌中的應(yīng)用

2.1 致病性研究及診斷應(yīng)用

WGS具備高通量及高分辨率的特點，可更加精確、快速地應(yīng)用于體液檢測。因而WGS有望應(yīng)用于消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖泌尿系統(tǒng)等疾病的臨床致病機制及藥物靶點研究，從而為其診斷及后續(xù)治療提供新思路。

大腸埃希菌、志賀菌、沙門菌均是常見的腸桿菌科類消化系統(tǒng)致病菌?；赪GS的應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌O157：H7的基因組變異主要歸因于某些噬菌體的動態(tài)性，使細(xì)菌菌株具有可變的毒力基因譜[1]；揭示了志賀菌的毒力因子具有協(xié)同致病機制[2]。

呼吸系統(tǒng)病原菌是醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)的首要源頭，其中耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌（KPC-KP）更是臨床治療攻克的難關(guān)。全基因組測序讓KPC-KP的診斷和治療有了新的進展：現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了幾株毒力基因高頻率出現(xiàn)的分離株的基因序列[3]；浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院余威團隊?wèi)?yīng)用WGS模擬技術(shù)證明了磷霉素聯(lián)合治療對大腸埃希菌的體外抗菌作用[4]。

美國、英國、中國等各大醫(yī)院發(fā)現(xiàn)臨床WGS可快速揭示與臨床癥狀對應(yīng)的相關(guān)基因序列，極大地降低了診斷的假陰性率[5]。根據(jù)致病菌的基因序列的測定，提出診斷依據(jù)，并做出療效評估，從而降低了醫(yī)院內(nèi)感染的發(fā)生率。

與傳統(tǒng)的實驗室檢測手段相比，WGS可直接應(yīng)用于血流中殘存病原體DNA的檢測，直接從液體血培養(yǎng)中收集抗性基因[6]，提供單種抗生素的敏感性測定及預(yù)測，避免了高抑制劑和人類細(xì)胞或DNA濃度對檢測設(shè)備及技術(shù)的限制；比較分離培養(yǎng)物和尿液標(biāo)本的WGS結(jié)果，直接從尿液中測序可以在多微生物樣品中進行細(xì)菌鑒定，可以在一些培養(yǎng)陰性的樣品中觀察到了其他可能的致病菌株。

由于同一基因序列的可存在于多種菌株的全基因組序列中，利用WGS技術(shù)可以橫向研究含同一基因的致病菌的發(fā)病機制，能夠為臨床標(biāo)本提供相關(guān)信息，大大縮短診斷時間，相對延長治療的黃金時間窗。WGS從基因遺傳性層面出發(fā)探究病原體的致病機理，為疾病病因的診斷，新菌種致病性提供了新的理論依據(jù)，在一定程度上降低了傳統(tǒng)檢測手段從形態(tài)、成分檢測上人為主觀因素影響造成的假陽性率和假陰性率，客觀地描述了致病菌的存在形式及所屬類別，同步提高了準(zhǔn)確度和可靠性。

此外，為了克服數(shù)據(jù)分析的障礙，已有研究開發(fā)了一種公開提供的生物信息工具[7]，這表明WGS已具備走出實驗室，應(yīng)用于臨床的條件。

2.2 耐藥機制研究

隨著抗生素的廣泛和不恰當(dāng)應(yīng)用及對醫(yī)院內(nèi)感染的逐步重視。使用全基因組測序儀對耐藥菌和標(biāo)準(zhǔn)菌中耐藥機制通路相關(guān)基因全序列及保守序列進行基因測序，計算機分析、識別已知基因與臨床耐藥相關(guān)的突變。由此，WGS可具象化挖掘出更罕見、多樣化的耐藥基因，提供多重耐藥菌基因型，并能夠準(zhǔn)確預(yù)測抗性表型，成為檢測細(xì)菌耐藥突變的寶貴工具。

在近幾年間，針對各耐藥菌的測序已在發(fā)達國家快速開展：美國報告了第一個完全組裝的產(chǎn)志賀毒素的志賀菌多藥耐藥全基因組序列[8]；湯姆·德曼報告了一種對所有26種抗生素都不敏感的肺炎克雷伯菌的基因組特征[9]；西班牙的一種罕見的碳青霉烯酶類型（IMP-8）被WGS鑒定為陰溝腸桿菌分離株[10]。由此可見，以基因突變?yōu)榛A(chǔ)的耐藥菌產(chǎn)生機制，已經(jīng)可以從“基因?qū)用妗边@一源頭找到監(jiān)測措施，證明了監(jiān)測程序作為檢測編碼抗菌素耐藥性的意外基因的有效工具的實用性。

面對多重耐藥基因，傳統(tǒng)分子研究技術(shù)需要分多次研究、拆分多個層次，從而不可避免的產(chǎn)生了針對性治療的局限性。WGS根據(jù)“化整為零”再“化零為整”的作用原理，可通過大規(guī)模并聯(lián)測序儀，同步對菌株實行全基因組序列多耐藥檢測，為后續(xù)的整體化治療奠定基礎(chǔ)。

2.3 流行病學(xué)研究

基于WGS的單核苷酸多態(tài)性分型和核心基因組多位點序列分型，通過全球同類致病菌基因的橫向比對，加速了致病菌來源的測定速度，可達到及時阻斷傳染源的傳播途徑，加速疫情控制的目的。

有文獻顯示，近年英國多個地區(qū)應(yīng)用WGS技術(shù)，迅速發(fā)現(xiàn)并切斷地中海、以色列等地的飲食來源致病菌的傳播途徑，有效地控制了腸道性疾病疫情的大規(guī)模暴發(fā)[11-12]；通過對亞洲內(nèi)外六個國家分離的60株耐環(huán)丙沙星的沙門菌進行基因組測序，發(fā)現(xiàn)在南亞地區(qū)識別的以導(dǎo)致個體患病的致病菌很可能正在推動目前環(huán)丙沙星耐藥沙門菌的在洲際的激增[13]。在無性系和碳青霉烯酶基因的多樣性上證明，產(chǎn)碳青霉屬腸桿菌科在挪威地區(qū)的傳播依然有限，其感染主要與出國旅行有關(guān)[14]。

與傳統(tǒng)分子追蹤技術(shù)相比，使用WGS進行的回顧性被動監(jiān)測在告知治療、識別區(qū)域流行病亞譜系方面具有實用價值，并為解釋前瞻性的、地方性的疾病提供一個框架?，F(xiàn)階段，美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）等共享數(shù)據(jù)庫中存在大約5200株肺炎克雷伯菌全基因組序列，這將有助于跟蹤這些致命性病原體的全球傳播[15]，表明將WGS應(yīng)用于分子流行病學(xué)研究，可以更好地了解多藥耐藥菌株在世界范圍內(nèi)的傳播情況，并可作為發(fā)現(xiàn)和確定現(xiàn)有和新現(xiàn)致病菌的一個強有力的監(jiān)測工具。

3 結(jié)語

綜上所述，全基因組測序能對菌株的多重耐藥基因譜、毒力基因譜進行同步分析，可直接在體液中鑒定致病菌的血清型，并對其進行分子分型診斷研究。同時隨著該技術(shù)在腸桿菌科細(xì)菌檢測上的日漸成熟，已有公開的信息分析平臺用于全基因組序列分析檢測對照，成為了腸桿菌科全球防控的有力監(jiān)測工具。而在其他致病菌中推廣時也發(fā)現(xiàn)，WGS現(xiàn)階段依舊存在基因譜構(gòu)建不全，適用范圍受限；技術(shù)成本高，生物信息分析標(biāo)準(zhǔn)化尚未實現(xiàn)；未知突變序列無法解釋等不足。希望未來通過努力能將這一快速檢測分型方法盡快應(yīng)用于臨床診斷及疾病防控，提高患者疾病的治愈率，提升國民生活質(zhì)量。