細(xì)胞壁降解酶在植物病原黃單胞菌致病性中的作用研究進(jìn)展*

郭 威， 高思涵， 孫楚韻， 方 潔， 盧娉婷， 戴瀟雨， 蘇如意

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

0 引 言

黃單胞菌屬(Xanthomonasspp.)細(xì)菌是自然界中普遍存在的一類革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌，其引起的植物病害遍布全世界.據(jù)統(tǒng)計，它們可侵染124種單子葉植物和268種雙子葉植物，其中包括重要糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，如水稻、棉花、大豆、柑橘、香蕉、辣椒、甘藍(lán)等[1-2].在溫暖潮濕的條件下，黃單胞菌可通過水孔、氣孔或傷口等部位侵入植物的不同器官，引發(fā)維管束萎蔫、潰瘍、黑腐、葉枯、葉斑或果斑等多種類型的植物病害，從而導(dǎo)致重大減產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)損失[3-4].

黃單胞菌侵染寄主植物過程可分為4個階段：接觸期、侵入期、潛育期和顯癥期[5-6].侵染初期，黃單胞菌附著在寄主植物表面，利用有限的營養(yǎng)生長繁殖[7].當(dāng)病原菌種群密度達(dá)到某一閾值時，通過群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)機制釋放大量的細(xì)胞壁降解酶(cell-wall degrading enzymes，CWDEs)，如纖維素酶、蛋白酶、內(nèi)切-β-甘露聚糖酶、果膠酶、脂肪酶/酯酶、α-淀粉酶、木聚糖酶等，降解植物細(xì)胞壁，形成傷口以利于病原菌侵入植物體內(nèi)[3，6].進(jìn)入植物體內(nèi)后，黃單胞菌通過相同的QS機制調(diào)控毒性相關(guān)基因的表達(dá)，以適應(yīng)寄主體內(nèi)環(huán)境；同時分泌大量的CWDEs，降解植物薄壁細(xì)胞/維管束，以利于病原菌獲取大量繁殖所需營養(yǎng)，并定殖到植物體內(nèi)，最終導(dǎo)致植物病害癥狀的產(chǎn)生[8-9].自20世紀(jì)70年代首次報道利用蛋白酶活性評價稻黃單胞菌株毒性指標(biāo)以來，隨后近半個世紀(jì)里，各國植物病理工作者就CWDEs的鑒定，以及CWDEs在黃單胞菌與寄主植物互作中的致病性及誘導(dǎo)抗病性作用等進(jìn)行了大量研究.筆者將詳細(xì)綜述植物病原黃單胞菌中已鑒定的CWDEs的生物學(xué)功能，以及CWDEs在寄主植物上的致病性和誘導(dǎo)抗病性作用.

1 植物病原黃單胞菌的Ⅱ型分泌系統(tǒng)

Ⅱ型分泌系統(tǒng)(type Ⅱ secretion system，T2SS)在植物及動物致病細(xì)菌中普遍存在，并被廣泛研究[10].病原菌Ⅱ型分泌蛋白(type Ⅱ secretion effectors，T2SEs)分泌至胞外需要2個步驟，首先通過Sec途徑(sec-dependent pathway)或雙精氨酸轉(zhuǎn)運途徑(twin-arginine translocation pathway，Tat)轉(zhuǎn)運穿過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜，釋放到外周胞質(zhì)間隙[11]；然后，再借助T2SS將外泌蛋白從外周胞質(zhì)間隙跨越外膜轉(zhuǎn)運至細(xì)胞表面或外部環(huán)境[11-12].通過T2SS，植物病原黃單胞菌將大量CWDEs、毒素等擴散至胞外，破壞或消解寄主植物抗侵染機械屏障，幫助病原菌適應(yīng)并定殖到植物細(xì)胞內(nèi)，從而引起組織壞死和病害[3-4].

植物病原黃單胞菌擁有2套T2SS，由11個xps基因編碼的Xps系統(tǒng)和由12個xcs基因編碼的Xcs系統(tǒng)組成[13].在辣椒斑點病菌(Xanthomonascampestrispv.vesicatoria，Xcv)中，Xps系統(tǒng)突變后，菌株的CWDEs活性幾乎全部減弱，但并不完全喪失；Xcs系統(tǒng)突變后，菌株的CWDEs活性及致病力并無影響，但xcs基因可以互補Xps系統(tǒng)中對應(yīng)同源基因的表型[14].這表明，Xps系統(tǒng)可能是黃單胞菌主要的T2SS；Xps與Xcs兩系統(tǒng)間具有一定的功能冗余或疊加.XpsD是T2SS外膜上的重要組分，起著分子伴侶作用，野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris，Xcc)的CWDEs需與其互作方可分泌至胞外[10].XcsD是否也具有分子伴侶的功能，與CWDEs互作以促進(jìn)其外泌，目前尚不明確.

2 細(xì)胞壁降解酶在植物病原黃單胞菌致病性中的作用

由T2SS分泌的CWDEs在植物病原黃單胞菌致病進(jìn)程中起著重要作用，它能瓦解由植物細(xì)胞壁構(gòu)筑的防御病原菌入侵的第一道機械屏障；同時能提供病原菌迅速繁殖所需養(yǎng)分，從而促進(jìn)病害癥狀的發(fā)展[3,6],甚至有些CWDEs自身就是致病因子[12,15-16].一種植物病原黃單胞菌能分泌多種CWDEs，具有多樣性.不同植物病原黃單胞菌所分泌的CWDEs也因菌株而異，具有特異性.在植物病原黃單胞菌致病進(jìn)程中，不同CWDEs需相互協(xié)作，具有協(xié)同性[17].

2.1 纖維素酶

纖維素酶是植物病原黃單胞菌分泌的,最重要的一類CWDEs，在破壞植物細(xì)胞促進(jìn)病原菌完成寄生性與致病性等方面起著重要作用.然而，目前有關(guān)植物病原黃單胞菌纖維素酶的研究，僅局限于少數(shù)幾個菌株.2001年，Schr?ter等[18]從XccNRLLB-1459菌株中鑒定出2個胞外纖維素酶基因engXCA(同源于KACC10331XOO4019)與engXCB(Xoo無同源基因)，engXCB基因?qū)甑陌饫w維素酶活性貢獻(xiàn)率僅8%，而engXCA/engXCB基因雙突變后，病原菌的胞外纖維素酶活性相對于野生型減弱5倍.2007年，Hu等[19]利用大腸桿菌(BL21/DE3)系統(tǒng)異位表達(dá)白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)PXO99A菌株的纖維素酶基因eglXoB(同源于KACC10331XOO0282)，在BL21/DE3菌株胞內(nèi)能檢測到明顯的纖維素酶活性，eglXoB基因突變后致使病原菌毒性相對于野生型減弱約87%.2007年，Jha等[20]從XooBXO43菌株中鑒定出2個胞外纖維素酶：ClsA(同源于KACC10331 XOO4019)與CbsA(同源于KACC10331 XOO4035)，clsA或cbsA基因單突變后，其菌株的胞外纖維素酶活性相對于野生型顯著減弱，并且顯著削弱病原菌的毒性與生長能力.此外，2016年，Xia等[12]利用大腸桿菌(BL21/DE3)系統(tǒng)異位表達(dá)柑橘潰瘍病菌(Xanthomonascitrisubsp.citri)的9個纖維素酶候選基因，從中鑒定出2個具有強烈纖維素酶活性的基因bglC3(同源于KACC10331XOO0283)與engXCA(同源于KACC10331XOO4019)；但是僅BglC3具有胞外纖維素酶活性，而EngXCA雖具有纖維素酶活性卻不能泌出胞外.由此可知，胞外纖維素酶在不同植物病原黃單胞菌菌株中存在差異.此外有研究表明，大豆斑疹病菌(Xanthomonasaxonopodispv.glycines，Xag)也具有顯著的胞外纖維素酶活性[21]，然而其胞外纖維素酶的編碼基因、數(shù)量、致病性及其他生物學(xué)特性如何，尚不清楚.

2.2 蛋白酶

自1975年日本學(xué)者首次用胞外蛋白酶活性來評判稻黃單胞菌菌株毒性變異以來，胞外蛋白酶活性一直是水稻條斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xoc)菌株毒性評價的重要指標(biāo)[22-23].植物病原黃單胞菌大部分菌株均具有胞外蛋白酶活性，然而有關(guān)蛋白酶的研究卻少有報道.在Xcc8004菌株中，全基因組注釋含有6個胞外蛋白酶基因，而PrtA(同源于Xac306 XAC0928)是其主要的胞外蛋白酶，prtA基因突變后，菌株的胞外蛋白酶活性幾乎完全喪失，致病性相對于野生型也顯著減弱[24].2012年，Zou等[16]從XocRS105菌株中鑒定出唯一的胞外蛋白酶EcpA(同源于Xac306 XAC2763)，ecpA突變后，菌株的蛋白酶活性完全喪失，致病性相對于野生型也顯著減弱.然而，稻黃單胞菌另一致病變種XooPXO86，T7174及PXO99A菌株雖擁有同源性完全一致的ecpA基因，PXO86與T7174菌株具有顯著的胞外蛋白酶活性[25]，而PXO99A菌株卻并不具有胞外蛋白酶活性[16,26]，表明EcpA并不是所有Xoo菌株的胞外蛋白酶.2008年，Thowthampitak等[21]曾指出，Xag12-2菌株具有強烈的胞外蛋白酶活性，但未鑒定出具體的胞外蛋白酶基因.本課題組近期研究也發(fā)現(xiàn)，Xag另一菌株NEAU001也同樣具有強烈的胞外蛋白酶活性，并從中共篩選出4個胞外蛋白酶，有趣的是，EcpA同源物并不在其中(未發(fā)表數(shù)據(jù)).由此可見，植物病原黃單胞菌的胞外蛋白酶很可能具有多樣性或菌株特異性.

2.3 果膠酶

由帶負(fù)電荷的酸性糖苷分子構(gòu)成的果膠，是植物細(xì)胞壁的重要組成部分[27].果膠酶又稱為聚半乳糖醛酸酶，是一種以裂解或消除作用切斷果膠質(zhì)中的糖苷鍵，并使果膠質(zhì)裂解成為多聚半乳糖醛酸的復(fù)合酶[28].根據(jù)對果膠分子作用方式的不同，可將果膠酶分為三大類：解聚酶(催化果膠解聚)、酯酶(催化果膠酯鍵水解)和原果膠酶(催化原果膠解聚)[28].絕大多數(shù)的植物病原真菌和細(xì)菌均能分泌果膠酶，各種果膠酶分子相互協(xié)作，降解寄主植物的果膠聚合物，使細(xì)胞壁疏松，以幫助病原菌克服由果膠組成的機械屏障，從而造成寄主植物葉斑病、軟腐病、枯萎病等癥狀[29].

在植物病原黃單胞菌中，有關(guān)果膠酶的研究也略有報道.2006年，Kaewnum等[30]從XagKU-P-34017菌株中鑒定出1個果膠裂解酶XagP(同源于KACC10331 XOO0821)，并證實XagP不僅是Xag果膠酶活性所必需的，而且還參與病原菌在非寄主煙草上過敏性反應(yīng)(hypersensitive response，HR)的誘導(dǎo).2008年，Wang等[15]從Xcc8004菌株中鑒定出2個果膠酶：PghA(同源于KACC10331 XOO3959)和PghB(同源于KACC10331 XOO2699)，并證實這2種酶是以依賴Xps的方式經(jīng)由T2SS分泌.此外，pghA與pghB基因受HrpX，HrpG及全局性調(diào)控子Clp正調(diào)控；兩基因雙突變后，菌株的果膠酶活性降低70%，致病性相對于野生型也顯著減弱.2016年，Tayi等[31]從白葉枯病菌XooBXO43菌株中鑒定出4個果膠酶：1個聚半乳糖醛酸酶PglA(同源于KACC10331 XOO2699)，1個果膠甲基酯酶Pmt(同源于KACC10331 XOO2696)和2個果膠裂解酶Pel(同源于KACC10331 XOO0821)與PelL(同源于KACC10331 XOO2265)，這4個果膠酶編碼基因分別突變后，菌株的果膠酶活性明顯降低，致病性相對于野生型也有所減弱.推斷果膠酶在不同植物病原黃單胞菌中很可能具有高度的同源性，它們除了參與病原菌的果膠酶活性、致病性外，還很可能具有一些其他生物學(xué)特性.

2.4 內(nèi)切-β-甘露聚糖酶

內(nèi)切-β-甘露聚糖酶不但可以水解半纖維素多糖，如甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、以及半乳葡甘露聚糖等的β-1,4-甘露糖骨架，而且還能通過松弛細(xì)胞壁來調(diào)控細(xì)胞伸長[32].內(nèi)切-β-甘露聚糖酶普遍存在于動物、植物及微生物中，在植物病原黃單胞菌中更是尤為廣泛.然而，相對于纖維素酶、蛋白酶及果膠酶等，有關(guān)內(nèi)切-β-甘露聚糖酶的研究報道卻相對較少.2003年，Dow等[33]從Xcc8004菌株中鑒定出1個內(nèi)切-β-甘露聚糖酶ManA(同源于Xcv85-10 XCV1826)，研究發(fā)現(xiàn)，manA基因及其編碼產(chǎn)物酶活性受DSF/rpf(diffusible signal factor，DSF/regulation of pathogenicity factors，rpf)系統(tǒng)正調(diào)控；manA基因突變后，菌株的內(nèi)切-β-甘露聚糖酶活性完全喪失，并且病原菌的毒性及生長能力相對于野生型顯著減弱；此外，還發(fā)現(xiàn)ManA能促使病原菌菌體由聚集態(tài)向游離態(tài)轉(zhuǎn)化，是驅(qū)散生物膜形成的分散酶.2010年，Hsiao等[34]再次證實，ManA是XccXc17菌株中唯一的內(nèi)切-β-甘露聚糖酶，manA基因突變后，菌株的甘露聚糖酶活性完全喪失；此外，還證實manA受刺槐豆膠(locust bean gum，LBG)誘導(dǎo)表達(dá)、并受RpfF及Clp正調(diào)控.2008年，Thowthampitak等[21]曾指出，Xag12-2菌株具有強烈的胞外內(nèi)切-β-甘露聚糖酶活性，但并未鑒定出具體的甘露聚糖酶編碼基因.推測ManA很可能是Xcc中唯一的內(nèi)切-β-甘露聚糖酶，那么ManA是否也是其他植物病原黃單胞菌中主要或唯一的內(nèi)切-β-甘露聚糖酶，是否對病原菌的致病性具有重要貢獻(xiàn)，有待于進(jìn)一步驗證.

除了上述提到的CWDEs外，植物病原黃單胞菌還能分泌出脂肪酶/酯酶、α-淀粉酶、木聚糖酶等.但是，不同植物病原黃單胞菌分泌CWDEs的酶活性及種類因菌株而異，或者說具有菌株特異性，例如：Xcc菌株不能分泌木聚糖酶，部分Xoo菌株不能分泌蛋白酶，而Xoc與Xag菌株分泌的果膠酶量/活性極少.在黃單胞菌與寄主植物互作過程中，各種CWDEs相互協(xié)作，破壞植物細(xì)胞壁以促進(jìn)病原菌在寄主植物上寄生與致病.與此同時，部分CWDEs本身就是黃單胞菌的毒性因子，在病原菌致病過程中起著重要作用.

3 植物病原黃單胞菌Ⅱ、Ⅲ型分泌系統(tǒng)相

互協(xié)作調(diào)控病原菌在寄主上的毒性由hrp-hrc-hpa基因簇編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，T3SS)是植物病原黃單胞菌中高度保守的、最重要的致病系統(tǒng)[35-36].通過T3SS，黃單胞菌將大量Ⅲ型效應(yīng)蛋白(type Ⅲ secretion effectors，T3SEs)注入寄主細(xì)胞，抑制寄主先天免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)病原菌在寄主植物上的寄生性與致病性[37-38].

由植物病原黃單胞菌T2SS分泌的CWDEs具有雙重功能，一方面能降解植物細(xì)胞壁，引起或促進(jìn)植物病害；另一方面能誘導(dǎo)植物防衛(wèi)反應(yīng)，如細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)、胼胝質(zhì)沉積(callose deposition)等.2007年，Jha等[20]研究發(fā)現(xiàn)，體外表達(dá)純化的XooBXO43菌株的纖維素酶(CbsA和ClsA)與脂肪酶/酯酶(LipA)均能誘導(dǎo)細(xì)胞壁相關(guān)的基礎(chǔ)免疫，如PCD、胼胝質(zhì)沉積等.2012年，Zou等[16]也發(fā)現(xiàn)，體外表達(dá)純化的Xoc胞外蛋白酶EcpA也能誘導(dǎo)類似的植物防衛(wèi)反應(yīng).2013年，Sinha等[38]采用農(nóng)桿菌系統(tǒng)瞬時表達(dá)XooBXO43菌株的T3SEs方式，從15個候選T3SEs中篩選出4個能抑制LipA誘導(dǎo)的細(xì)胞壁相關(guān)基礎(chǔ)免疫的效應(yīng)蛋白，如XopN，XopQ，XopX和XopZ.2016年，Tayi等[39]首次報道，XooBXO43菌株的纖維素酶(CbsA和ClsA)和木聚糖酶(Xyn)在病原菌侵染過程中均能誘導(dǎo)細(xì)胞壁相關(guān)的基礎(chǔ)免疫，而脂肪酶/酯酶(LipA)和果膠酶(PglA)在病原菌侵染過程中并不能誘導(dǎo)這種基礎(chǔ)免疫.上文所引用的3位作者Jha，Sinha與Tayi均來自于印度學(xué)者Ramesh的課題組，該研究小組在植物病原黃單胞菌CWDEs誘導(dǎo)植物先天免疫反應(yīng)領(lǐng)域作出了重要貢獻(xiàn).比較Jha與Tayi的論文可推測，在體外條件下植物病原黃單胞菌CWDEs均能誘導(dǎo)植物細(xì)胞壁相關(guān)的基礎(chǔ)免疫，而在體內(nèi)條件下CWDEs是否能誘導(dǎo)這種基礎(chǔ)免疫很可能取決于自身分泌活性或量的大小.Ramesh研究組[39]指出，黃單胞菌CWDEs誘導(dǎo)的細(xì)胞壁相關(guān)的這種基礎(chǔ)免疫，是源于CWDEs破壞寄主植物細(xì)胞壁而釋放的損害相關(guān)分子(damage-associated molecular patterns，DAMPs)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的免疫反應(yīng).然而，目前為止，關(guān)于DAMPs的真實身份還一無所知.此外，關(guān)于能抑制CWDEs誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)的T3SEs也知之甚少.

4 總結(jié)與展望

過去近半個世紀(jì)的研究工作充分證明，植物病原黃單胞菌CWDEs至少具有以下特點：1)具有多樣性，一種植物病原黃單胞菌能分泌多種CWDEs；2)具有特異性，不同植物病原黃單胞菌所分泌的CWDEs因菌株而異；3)具有協(xié)同性，在植物病原黃單胞菌致病進(jìn)程中，不同CWDEs需相互協(xié)作；4)具有雙重功能，一方面能降解植物細(xì)胞壁，促進(jìn)或引起植物病害；另一方面能誘導(dǎo)植物防衛(wèi)反應(yīng)，如PCD、胼胝質(zhì)沉積等.然而這些研究工作主要集中在維管束病原菌Xcc與Xoo上，在其他植物病原黃單胞菌(如薄壁細(xì)胞病原菌Xag)上還鮮有報道.此外，在黃單胞菌CWDEs與寄主植物互作機制等方面，還有許多科學(xué)問題需要回答.因而，未來研究工作應(yīng)包括以下方面：1)鑒定其他植物病原黃單胞菌的CWDEs，并揭示不同菌株CWDEs的差異性與多樣性；2)全基因組內(nèi)挖掘CWDEs誘導(dǎo)致使寄主植物顯著變化的基因，特別是病程相關(guān)基因(pathogenesis-related genes)等；3)探究不同類CWDEs在誘導(dǎo)寄主植物先天免疫反應(yīng)上，是否具有功能疊加或冗余，抑或具有協(xié)同作用；4)鑒定由CWDEs破壞寄主植物細(xì)胞壁而釋放的DAMPs；5)篩選抑制CWDEs所誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)的T3SEs，并揭示其抑制先天免疫反應(yīng)的方式；6)探究參與CWDEs誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)的受體、信號元件及轉(zhuǎn)錄因子等.在這些領(lǐng)域開展廣泛的研究，無疑將促進(jìn)對黃單胞菌與寄主植物互作機理更深入的理解，為植物細(xì)菌病害的生物防治策略開拓新的途徑.