西瓜葉片防御酶活性與枯萎病抗性的關(guān)系

，年來(lái)

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院，甘肅 武威 733006; 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

西瓜[Citrulluslanatus(Thunb) Manf.]是葫蘆科西瓜屬1年生蔓性草本植物，原產(chǎn)非洲[1]。我國(guó)是世界上西瓜生產(chǎn)與消費(fèi)量最大的國(guó)家，2010年西瓜種植面積和產(chǎn)量分別達(dá)181.25萬(wàn)hm2和6818.1萬(wàn)t[2]，西瓜產(chǎn)業(yè)在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著重要地位，在農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整與農(nóng)民增收中發(fā)揮著重要作用[3]。西瓜枯萎病是由半知菌亞門鐮刀菌屬(FusariumLink ex Fr．)尖孢鐮刀菌西瓜專化型(Fusariumoxysporumf.sp.niveum,FON)侵染引起的真菌土傳病害，隨著西瓜種植面積的擴(kuò)大，輪作倒茬日益困難，西瓜枯萎病大面積發(fā)生和流行[4]，嚴(yán)重制約了我國(guó)西瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[5]。因此，開展西瓜枯萎病抗性研究對(duì)于西瓜高產(chǎn)高效生產(chǎn)具有重要意義。

鄒芳斌等[6]、趙秀娟等[7]、劉守偉等[8]、GIROUSSE等[9]對(duì)病原菌侵染后寄主植株的各種生理生化代謝反應(yīng)與抗病性的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)植物體在受病原菌侵染后，作為苯丙烷類代謝定速酶的苯丙氨酸解氨酶( PAL)，參與酚類氧化或縮合的過(guò)氧化物酶(POD)[10]、多酚氧化酶(PPO)[11]和具有保護(hù)作用的超氧化物歧化酶(SOD) 等的活性會(huì)發(fā)生顯著變化。丁九敏等[12]在霜霉病菌侵染黃瓜試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抗病品種黃瓜葉片SOD活性極顯著高于感病品種，葉片的SOD活性與霜霉病抗性呈正相關(guān)。吳岳軒等[13]對(duì)水稻白葉枯病、周曉慧等[14]對(duì)甜瓜蔓枯病的研究發(fā)現(xiàn)，POD[13]、過(guò)氧化氫酶(CAT)[14]活性均與抗性呈正相關(guān)。徐敬華等[15]研究發(fā)現(xiàn)，PAL活性表達(dá)呈周期性變化，葉片是PAL活性高效表達(dá)的部位，其酶活性與西瓜枯萎病抗性呈正相關(guān)?？梢姡参锏目?耐)病性與其體內(nèi)的防御酶活性密切相關(guān)，但采用國(guó)際上公認(rèn)的西瓜枯萎病鑒別寄主來(lái)研究植株受侵染后抗性相關(guān)酶活性與抗病性的關(guān)系鮮見報(bào)道。

本試驗(yàn)以西瓜枯萎病鑒別寄主(高抗品種PI296341-FR、輕抗品種Crimson Sweet和高感品種Sugar Baby)為材料，采用西瓜枯萎病菌孢子懸浮液進(jìn)行人工接種，比較分析了抗感性不同西瓜品種接種枯萎病菌前后葉片SOD、POD、PPO、PAL、CAT活性的變化，以期為進(jìn)一步闡釋西瓜枯萎病生化抗性機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用對(duì)尖孢鐮刀菌西瓜專化型1號(hào)生理小種具有不同抗性的3個(gè)西瓜品種[5]：高抗品種PI296341-FR(C.lanatusvar.citroides)、輕抗品種Crimson Sweet(C.lanatusvar.lanatus)和高感品種Sugar Baby(C.lanatusvar.lanatus)，種子由國(guó)家蔬菜工程技術(shù)研究中心提供。

供試菌種：西瓜枯萎病菌選用國(guó)際公認(rèn)的尖孢鐮刀菌西瓜?；?號(hào)生理小種，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所何蘇琴研究員提供。供試菌種于試驗(yàn)前進(jìn)行復(fù)壯，單孢純化。

1.2 西瓜枯萎病菌孢子懸浮液的制備

病原菌于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，然后用手持打孔器將西瓜枯萎病菌菌片轉(zhuǎn)接到馬鈴薯蔗糖(PS)液體培養(yǎng)基中，每個(gè)50 mL三角瓶接3片，放入搖床在28 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)7 d。再用雙層消毒紗布過(guò)濾，菌液經(jīng)5 000 r/min離心20 min，棄去上清液得到白色孢子沉淀，加無(wú)菌蒸餾水適當(dāng)稀釋，經(jīng)Neubauer血球計(jì)數(shù)板(0.1 mm，1/400 mm2)計(jì)算，配成濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，作侵染菌液備用。

1.3 育苗及接種處理

供試西瓜種子用0.1%的高錳酸鉀溶液浸泡30 min，溫湯(50～55 ℃)浸種6 h 后，用濕毛巾包裹置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)催芽，待種子露白后選擇芽長(zhǎng)基本一致的種子播種于穴盤滅菌基質(zhì)(按V蛭石∶V珍珠巖=3∶1混合)中，在25～28 ℃溫室內(nèi)進(jìn)行育苗。子葉生長(zhǎng)期每穴每隔7 d澆灌一次5 mL 1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，真葉展出后每穴每隔4～5 d澆灌一次5 mL Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液。待幼苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，采用灌根法[16]進(jìn)行接種處理，在距幼苗根部0.5～1 cm處用注射器注入5 mL孢子懸浮液。接種處理每品種接菌24株，不接種處理以灌蒸餾水作為對(duì)照(CK)，每品種灌蒸餾水24株，3次重復(fù)。

1.4 取樣方法

分別于接種前0 d，接種處理后1、2、3、4、5 d取自上而下第2片充分展開的葉片，每個(gè)處理隨機(jī)取10株，3次重復(fù)，將每個(gè)處理的樣品稱質(zhì)量后(約2.5 g)放入-80 ℃超低溫冰箱保存作為待測(cè)樣本。

1.5 酶活性測(cè)定

SOD活性測(cè)定參照裴斌等[17]的方法，采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定，以抑制NBT光化學(xué)還原50%為1個(gè)酶活性單位(U)；POD活性測(cè)定參照李合生[18]的方法，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，以愈創(chuàng)木酚為底物，以1 min內(nèi)OD470變化0.2為1個(gè)酶活性單位(U)；PPO活性測(cè)定參照李合生[18]的方法，采用鄰苯二酚法測(cè)定，以0.02 mol/L鄰苯二酚為底物，以1 min內(nèi)OD398變化0.001為1個(gè)酶活性單位(U)；PAL活性測(cè)定參照李合生[18]的方法，采用苯丙氨酸法測(cè)定，以0.02 mol/L L-苯丙氨酸為底物，以O(shè)D290變化0.01為1個(gè)酶活性單位(U)；CAT活性測(cè)定參照裴斌[17]的方法，采用紫外吸收法測(cè)定，以1 min內(nèi)OD240降低0.1為1個(gè)酶活性單位(U)。每個(gè)酶活性指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel(2007版) 計(jì)算試驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖，用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并運(yùn)用Duncan’s檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗性西瓜品種葉片的SOD活性變化

隨著接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，3個(gè)對(duì)照西瓜品種葉片SOD活性變化不大，接菌處理后，抗病品種葉片SOD活性顯著升高，3個(gè)西瓜品種葉片SOD活性變化均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)(圖1)。接種后，高抗品種PI296341-FR和輕抗品種Crimson Sweet葉片SOD活性迅速增加，均在第2天達(dá)到峰值，分別較各自未接種對(duì)照增加了58.98%、73.01%(P≤0.05)，較感病品種Sugar Baby分別增加了47.62%、34.56%(P≤0.05)，之后開始下降。而感病品種Sugar Baby在接種后第3天葉片SOD活性才達(dá)到峰值，較接種處理前0 d增加了36.60%(P≤0.05)，之后活性開始下降。從3個(gè)品種的SOD活性變化來(lái)看，接種西瓜枯萎病菌可顯著提高西瓜葉片SOD活性，抗病品種酶活性峰值出現(xiàn)時(shí)間早于感病品種，抗病品種葉片SOD活性變化幅度顯著高于感病品種。

圖1 接種西瓜枯萎病菌后葉片SOD活性變化Fig.1 The change of SOD activity of leaves after inoculation with Fusarium oxysporum f. sp. niveum

2.2 不同抗性西瓜品種葉片的POD活性變化

隨著接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，3個(gè)對(duì)照西瓜品種葉片POD活性變化不大，接菌處理后3個(gè)品種葉片POD活性有所升高，均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)(圖2)。接種后，高抗品種PI296341-FR和輕抗品種Crimson Sweet葉片POD活性迅速增加，均在第2天達(dá)到峰值，分別較各自未接種對(duì)照增加了26.08%、22.33%(P≤0.05)，較感病品種Sugar Baby分別增加了22.75%、10.10%(P≤0.05)，之后開始下降。而感病品種Sugar Baby在接種后1 d葉片POD活性雖略有升高但增速緩慢，至第3天時(shí)才達(dá)到活性峰值，較接種處理前0 d增加了8.52%，之后活性開始下降。從3個(gè)品種葉片POD活性變化來(lái)看，接種西瓜枯萎病菌可顯著提高西瓜葉片POD活性，抗病品種酶活性峰值出現(xiàn)時(shí)間早于感病品種，抗病品種葉片POD活性變化幅度顯著高于感病品種。

圖2 接種西瓜枯萎病菌后葉片POD活性變化Fig.2 The change of POD activity of leaves after inoculation with Fusarium oxysporum f. sp. niveum

2.3 不同抗性西瓜品種葉片的PPO活性變化

接種處理的3個(gè)西瓜品種PPO活性均顯著高于對(duì)照(P≤0.05)，說(shuō)明西瓜枯萎病菌接種處理可顯著提高葉片PPO活性(圖3)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，接種后3個(gè)品種葉片的PPO活性變化趨勢(shì)基本一致，均表現(xiàn)為先升高后下降。高抗品種PI296341-FR和輕抗品種Crimson Sweet在接種后第2天葉片PPO活性均達(dá)到峰值，高抗品種較未接種對(duì)照和感病品種Sugar Baby提高了69.87%、19.91%(P≤0.05)，輕抗品種Crimson Sweet較未接種對(duì)照提高了62.59%(P≤0.05)，而感病品種Sugar Baby葉片PPO活性增速緩慢，活性峰值在第3天出現(xiàn)。接種處理后3個(gè)西瓜品種在達(dá)到酶活性峰值時(shí)，高抗品種PI296341-FR和輕抗品種Crimson Sweet葉片PPO活性較接種前分別提高了57.74%、53.21%(P≤0.05)，而感病品種Sugar Baby葉片PPO活性較接種前提高了25.93%；抗病品種在接種第2天后，葉片PPO活性緩慢下降，而感病品種則在接種第3天后，葉片PPO活性迅速下降?？梢姡鞴峡菸【臃N處理可顯著提高西瓜葉片PPO活性，抗病品種酶活性峰值出現(xiàn)時(shí)間早于感病品種，抗病品種PPO活性變化幅度顯著高于感病品種。

2.4 不同抗性西瓜品種葉片的PAL活性變化

接種處理前3個(gè)西瓜品種的PAL活性無(wú)顯著差異，接種處理后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，3個(gè)品種的PAL活性變化均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)(圖4)，說(shuō)明枯萎病菌接種處理可以顯著提高西瓜葉片PAL活性。高抗品種PI296341-FR在接種后2 d葉片PAL活性達(dá)到峰值，分別較未接種對(duì)照和感病品種Sugar Baby提高了70.70%、20.65%(P≤0.05)，然后PAL活性呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，輕抗品種Crimson Sweet葉片PAL活性在接種后1 d達(dá)到峰值，較未接種對(duì)照提高了33.34%(P≤0.05)，之后緩慢下降趨于穩(wěn)定。而感病品種Sugar Baby在接種后3 d葉片PAL活性才達(dá)到峰值，之后逐漸降低，抗病品種的酶活性峰值出現(xiàn)時(shí)間均早于感病品種。接種處理后3個(gè)西瓜品種在達(dá)到酶活性峰值時(shí)，高抗品種PI296341-FR和輕抗品種Crimson Sweet葉片PAL活性分別較接種前提高了73.17%、65.91%(P≤0.05)，而感病品種Sugar Baby葉片PAL活性較接種前提高了34.08%(P≤0.05)。從3個(gè)西瓜品種葉片PAL活性變化來(lái)看，西瓜枯萎病菌接種處理可顯著提高西瓜葉片PAL活性，抗病品種酶活性峰值出現(xiàn)時(shí)間早于感病品種，抗病品種PAL活性變化幅度顯著高于感病品種。

圖3 接種西瓜枯萎病菌后葉片PPO活性變化Fig.3 The change of PPO activity of leaves after inoculation with Fusarium oxysporum f. sp. niveum

圖4 接種西瓜枯萎病菌后葉片PAL活性變化Fig.4 The change of PAL activity of leaves after inoculation with Fusarium oxysporum f. sp. niveum

2.5 不同抗性西瓜品種葉片的CAT活性變化

隨著接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，3個(gè)對(duì)照西瓜品種葉片的CAT活性變化不大，接菌處理后3個(gè)西瓜品種葉片的CAT活性均顯著升高(P≤0.05)，且呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)(圖5)。高抗品種PI296341-FR和輕抗品種Crimson Sweet在接種后2 d葉片CAT活性均達(dá)到峰值，且高于感病品種，高抗品種PI296341-FR和輕抗品種Crimson Sweet葉片CAT活性分別較各自未接種對(duì)照提高78.00%、63.46%(P≤0.05)，較感病品種提高了41.79%、28.40%(P≤0.05)。在第2天達(dá)到峰值時(shí)，高抗品種和輕抗品種葉片CAT活性分別較接種前0 d提高了86.99%、79.58%(P≤0.05)，而感病品種Sugar Baby葉片CAT活性在接種后第3天才達(dá)到峰值，較接種前0 d提高了54.37%(P≤0.05)。說(shuō)明西瓜枯萎病菌接種處理可顯著提高西瓜葉片CAT活性，抗病品種酶活性峰值出現(xiàn)時(shí)間早于感病品種，抗病品種葉片CAT活性變化幅度顯著高于感病品種。

圖5 接種西瓜枯萎病菌后葉片CAT活性變化Fig.5 The change of CAT activity of leaves after inoculation with Fusarium oxysporum f. sp. niveum

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，西瓜枯萎病菌接種處理后，3個(gè)西瓜品種葉片SOD、POD、PPO、PAL、CAT活性較對(duì)照均有顯著提高，抗病品種PI296341-FR和Crimson Sweet葉片的SOD、POD、PPO、PAL、CAT活性峰值出現(xiàn)時(shí)間早于感病品種Sugar Baby，酶活性增幅顯著高于感病品種。SOD、POD、PPO、PAL、CAT 5種防御酶活性變化與西瓜抗病性密切相關(guān)，在西瓜枯萎病抗性生化機(jī)制中起重要作用，SOD、POD、PPO、PAL、CAT活性峰值大小及出現(xiàn)時(shí)間的早晚可作為西瓜枯萎病抗性篩選的重要生化指標(biāo)。

3.1 SOD、POD、CAT與西瓜枯萎病抗性的關(guān)系

植物的防衛(wèi)反應(yīng)是在酶催化下一系列復(fù)雜生理生化代謝的結(jié)果[19]，與植物的抗病性密切相關(guān)，SOD、POD、CAT等抗氧化酶類通常用作衡量植物體內(nèi)防衛(wèi)反應(yīng)的重要指標(biāo)[20-21]。植物感染病原菌后，體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和消除的代謝平衡受到破壞，過(guò)剩的活性氧能引發(fā)和加劇膜脂過(guò)氧化作用，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，代謝系統(tǒng)紊亂，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡，而SOD、POD、CAT是植物體內(nèi)擔(dān)負(fù)清除活性氧的保護(hù)酶系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶[6]，這幾種酶活性的增加表明清除自由基的能力增強(qiáng)，降低了膜脂過(guò)氧化作用，從而維護(hù)細(xì)胞的正常代謝[22]。一般植物感染病原菌后，抗感品種的抗氧化酶活性均會(huì)升高。李新等[22]通過(guò)黃瓜枯萎病的研究發(fā)現(xiàn)，POD、SOD活性的變化與黃瓜的抗病性呈正相關(guān)關(guān)系。侯茜等[23]、孫正祥等[24]對(duì)西瓜枯萎病的研究均表明，POD 和 CAT活性與植物的抗病性呈正相關(guān)。但也有不同觀點(diǎn)，云興福[25]對(duì)黃瓜感染霜霉病的研究認(rèn)為，SOD活性與抗病性呈負(fù)相關(guān)，POD活性與抗病性呈正相關(guān)。房保海等[26]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)煙草接種低頭黑病菌后，感病品種POD活性增加快，始終高于抗病品種。

本試驗(yàn)對(duì)不同抗性的西瓜品種接種枯萎病菌后，SOD、POD、CAT活性的動(dòng)態(tài)分析表明，無(wú)論是西瓜抗病品種還是感病品種，在受枯萎病菌侵染后，其植株體內(nèi)的細(xì)胞都會(huì)做出抗性反應(yīng)，表現(xiàn)為SOD、POD、CAT活性的提高，但抗病、感病品種之間的反應(yīng)快慢存在差異，抗病品種對(duì)接種處理較為敏感，接種后3種酶活性迅速增加，較早達(dá)到活性峰值，而感病品種則對(duì)接種處理反應(yīng)較為遲鈍，接種后酶活性緩慢增加，活性峰值出現(xiàn)較晚，達(dá)活性峰值后迅速下降，這與趙秀娟等[7]對(duì)苦瓜枯萎病的抗性研究結(jié)果相一致，齊紹武等[27]在研究甘藍(lán)型油菜接種菌核病菌后也得到相同的結(jié)論。針對(duì)抗感西瓜品種葉片的POD活性變化，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，接種枯萎病菌后，抗感品種葉片POD活性都呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)，但抗病品種POD活性始終高于感病品種，且抗病品種在接種處理后酶反應(yīng)變化幅度更顯著，酶活性增幅更大，這與李新等[22]的研究結(jié)果相同，但與劉守偉等[8]在黃瓜枯萎病抗性試驗(yàn)中得出的結(jié)果不完全相同，可能的原因是所選擇的試驗(yàn)材料或取樣部位不同，有待進(jìn)一步深入研究。本試驗(yàn)所用抗病西瓜品種對(duì)接種處理更為敏感，枯萎病菌侵染細(xì)胞后膜系統(tǒng)受損，透性增加，酶促反應(yīng)加速，酶活性提高，表現(xiàn)為抗病品種的POD活性變化幅度顯著大于感病品種，這也再次反映出接種處理后植物細(xì)胞的膜系統(tǒng)受損是抗氧化酶類發(fā)生顯著變化的根本原因。

3.2 PPO、PAL與西瓜枯萎病抗性的關(guān)系

PPO[28]、PAL[29-30]活性與植物抗病性密切相關(guān)。PAL是植物抗病性物質(zhì)生成途徑——苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，PAL活性的提高有利于抗性物質(zhì)木質(zhì)素含量的增加[31]；PPO可催化酚類物質(zhì)氧化成醌，造成木質(zhì)素大量合成并積累于細(xì)胞壁間，增加細(xì)胞壁抗病原物的穿透壓力，阻止病原菌的侵入繁殖或鈍化毒素[32]。陳年來(lái)等[30]研究認(rèn)為，植物的抗病性強(qiáng)弱決定于體內(nèi)抗性基因表達(dá)后發(fā)生抗病反應(yīng)的速度和積累抗病物質(zhì)的速度與數(shù)量。本試驗(yàn)通過(guò)研究抗感西瓜品種葉片PPO和PAL活性的變化發(fā)現(xiàn)，接種后3個(gè)品種西瓜葉片的PPO和PAL活性均顯著升高，可能是由于枯萎病菌的侵染激活了PPO和PAL基因的表達(dá)，而由PPO催化形成的醌類物質(zhì)以及PAL誘導(dǎo)合成的大量木質(zhì)素在一定程度上限制了病菌的擴(kuò)散；接種后抗病品種葉片的PPO和PAL活性及增幅均顯著高于對(duì)照和感病品種，原因之一是接種枯萎病菌后抗病品種葉片PPO和PAL 2種防御酶活性表達(dá)水平較高，酶活性的高水平表達(dá)也是植物應(yīng)對(duì)病菌侵染的抗性反應(yīng)，以適應(yīng)逆境；抗病品種葉片PPO和PAL活性峰值的出現(xiàn)時(shí)間均早于感病品種，可能是由于抗病品種的一些早期防衛(wèi)反應(yīng)出現(xiàn)較早，酶促反應(yīng)速度快，催化誘導(dǎo)形成的酚類物質(zhì)積累早，而感病品種雖有防御能力，但酶誘導(dǎo)速度和強(qiáng)度均較抗病品種差，來(lái)不及或不足以抑制病原菌生長(zhǎng)，所以感病品種出現(xiàn)酶活性峰值的時(shí)間比抗病品種晚，這也是感病品種易感染西瓜枯萎病的真正原因。這與馬艷玲等[32]在黃瓜枯萎病，劉亞光等[33]在大豆灰斑病，趙秀娟等[7]在苦瓜枯萎病以及侯茜等[23]在西瓜枯萎病抗性研究中得出的結(jié)論相同。