復(fù)合益生菌液態(tài)發(fā)酵黃芪的制備方法

，，，，，，

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046; 2.鄭州市益生菌發(fā)酵中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046;3.河南省益生菌生物轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046; 4.河南省微生物生物轉(zhuǎn)化中藥工程實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046; 5.鄭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，河南 鄭州 450007)

中草藥是目前公認(rèn)的綠色飼料添加劑，其在增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力、抗菌、抗病毒等方面具有良好的作用效果[1-2]。但是中草藥在臨床應(yīng)用中也存在一定缺點(diǎn)，如添加量較大、適口性較差、成本較高等，對(duì)其在動(dòng)物生產(chǎn)上的推廣與應(yīng)用產(chǎn)生了不利的影響。常作為飼料添加劑的益生菌如枯草芽孢桿菌、乳酸菌等，具有增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力、調(diào)整腸道菌群平衡、維持腸黏膜完整性及提高腸道消化吸收功能的作用[3-4]。結(jié)合現(xiàn)代微生物發(fā)酵工程技術(shù)，利用益生菌對(duì)中草藥進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化是對(duì)中草藥炮制方法的創(chuàng)新，該技術(shù)能提高中草藥的臨床應(yīng)用效果，主要表現(xiàn)在減少用藥劑量、提高有效成分作用速率以及具有多功能性等，并且能降低某些藥物的毒副作用[5]。一方面，中草藥黃芪在提高動(dòng)物機(jī)體免疫力、抗應(yīng)激和抗氧化能力方面具有良好的作用效果，并且對(duì)枯草芽孢桿菌和乳酸菌等益生菌的體外增殖具有良好的促進(jìn)作用；另一方面，黃芪經(jīng)益生菌發(fā)酵后臨床效果得到加強(qiáng)，用量減小的同時(shí)，提高了臨床應(yīng)用價(jià)值[6-7]。目前，關(guān)于發(fā)酵黃芪制劑的開(kāi)發(fā)研究，主要集中于利用1種或1類(lèi)益生菌對(duì)黃芪進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，多菌種混合發(fā)酵研究較少。本研究利用枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌對(duì)黃芪進(jìn)行分段復(fù)合發(fā)酵，旨在增強(qiáng)益生菌對(duì)黃芪生物轉(zhuǎn)化的效果，發(fā)揮多菌種協(xié)同作用，加強(qiáng)復(fù)合益生菌黃芪發(fā)酵制劑的多功能特性，提高其臨床應(yīng)用效果。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及主要儀器

試驗(yàn)用黃芪飲片購(gòu)于亳州藥材市場(chǎng)；枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌菌種由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院發(fā)酵中藥實(shí)驗(yàn)室保存；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、莫匹羅星鋰鹽MRS培養(yǎng)基均購(gòu)于北京澳博星生物技術(shù)有限公司；馬鈴薯液體、瓊脂培養(yǎng)基(含氯霉素)均購(gòu)于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于寧波萊?？萍加邢薰荆缓銣?fù)u床購(gòu)于天津路業(yè)實(shí)驗(yàn)儀器公司；電子天平購(gòu)于鄭州通渠商貿(mào)有限公司；200 L全自動(dòng)發(fā)酵罐購(gòu)于鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司。

1.2 菌種活化

將枯草芽孢桿菌、酵母菌及乳酸菌菌種的甘油凍存管置于室溫，融化后用無(wú)菌接種環(huán)挑取少量菌種分別劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂(含氯霉素)培養(yǎng)基和莫匹羅星鋰鹽MRS瓊脂培養(yǎng)基，分別在37、28、37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，然后將其轉(zhuǎn)接至相應(yīng)液體培養(yǎng)基，適宜條件下培養(yǎng)24 h后備用。

1.3 黃芪提取液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的黃芪飲片，分別加5、4、4倍量的水，煮沸3次，每次約40 min，分別留取每次濾液，最后合并3次濾液并濃縮至黃芪質(zhì)量濃度為0.5 g/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 黃芪添加量、發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件

黃芪提取液的添加量為：每毫升培養(yǎng)基中含黃芪0.5 g。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：每100 mL培養(yǎng)基中含黃芪50.0 g、豆粕2.0 g、玉米2.0 g、麩皮2.5 g；培養(yǎng)基初始pH值均為8.00，裝液量均為100 mL(500 mL三角瓶)[8]?？莶菅挎邨U菌、酵母菌和乳酸菌發(fā)酵溫度分別為37、28、37 ℃，乳酸菌靜置培養(yǎng)，枯草芽孢桿菌和酵母菌置恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速160 r/min培養(yǎng)。

1.5 復(fù)合菌種分段發(fā)酵黃芪條件測(cè)定

1.5.1 菌種接種順序?qū)w生長(zhǎng)的影響 取制備好的培養(yǎng)基18瓶，隨機(jī)分為1—6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3瓶。按表1所示順序組合將菌種分別在一定的時(shí)間點(diǎn)按1.0%的接種量接種至培養(yǎng)基中，接種后培養(yǎng)時(shí)間均為24 h，培養(yǎng)結(jié)束后鏡檢各菌種的生長(zhǎng)情況及pH值，接種的相應(yīng)菌種生長(zhǎng)用“√”表示，接種的相應(yīng)菌種未生長(zhǎng)用“-”表示。

表1 菌種接種順序 Tab.1 The inoculation order of strains

1.5.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響 采用單因子試驗(yàn)法，取制備好的培養(yǎng)基15瓶，隨機(jī)分為1—5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3瓶。1—5組均按3.0%接種量接入枯草芽孢桿菌[9]，分別在接種后的24、36、48、60、72 h，取樣測(cè)定枯草芽孢桿菌數(shù)量，同時(shí)各組均按1.0%接種量接入酵母菌，培養(yǎng)24 h后測(cè)定酵母菌數(shù)量。

1.5.3 酵母菌最適接種量的測(cè)定 采用單因子試驗(yàn)法，取制備好的培養(yǎng)基15瓶，隨機(jī)分為1—5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3瓶。1—5組均按3.0%接種量接入枯草芽孢桿菌，按1.5.2中所得最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)后，各組分別按0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的接種量接入酵母菌，培養(yǎng)24 h后測(cè)定酵母菌的數(shù)量。

1.5.4 酵母菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響 采用單因子試驗(yàn)法，取制備好的培養(yǎng)基15瓶，隨機(jī)分為1—5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3瓶。1—5組均按3.0%的接種量接入枯草芽孢桿菌，按照1.5.2中所得最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)，然后均按1.5.3中所得最佳接種量接入酵母菌，分別在接種后的24、36、48、60、72 h，取樣并測(cè)定酵母菌數(shù)量，同時(shí)各組均按1.0%的接種量接入乳酸菌，培養(yǎng)24 h后測(cè)定乳酸菌數(shù)量。

1.5.5 乳酸菌最適接種量的測(cè)定 采用單因子試驗(yàn)法，取制備好的培養(yǎng)基15瓶，隨機(jī)分為1—5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3瓶。1—5組均按3.0%的接種量接入枯草芽孢桿菌，按照1.5.2中所得最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)，然后均按1.5.3中所得最佳接種量接入酵母菌，再按照1.5.4中所得最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)后，各組分別按0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的接種量接入乳酸菌，培養(yǎng)24 h后測(cè)定乳酸菌的數(shù)量。

1.5.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響 采用單因子試驗(yàn)法，取制備好的培養(yǎng)基15瓶，隨機(jī)分為1—5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3瓶。1—5組均按3.0%的接種量接入枯草芽孢桿菌，按照1.5.2中所得最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)，然后均按1.5.3中所得最佳接種量接入酵母菌，再按照1.5.4中所得最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)，最后各組均按1.5.5中所得最佳接種量接入乳酸菌，分別在培養(yǎng)24、36、48、60、72 h時(shí)，取樣并測(cè)定乳酸菌數(shù)量。

1.6 中試擴(kuò)大試驗(yàn)

為進(jìn)一步確定上述搖瓶試驗(yàn)結(jié)果的實(shí)用性，利用200 L全自動(dòng)不銹鋼發(fā)酵罐及篩選后的培養(yǎng)基進(jìn)行中試擴(kuò)大試驗(yàn)，并檢測(cè)發(fā)酵液各菌種的數(shù)量和發(fā)酵終點(diǎn)pH值。培養(yǎng)基初始pH值為8.00，裝液量為70%；枯草芽孢桿菌發(fā)酵溫度為37 ℃，接種量為3.0%，電機(jī)轉(zhuǎn)速為250 r/min，通氣量為0.05 m3/min；酵母菌發(fā)酵溫度為28 ℃，電機(jī)轉(zhuǎn)速為250 r/min，通氣量為0.05 m3/min；其他發(fā)酵條件按照1.5中所得的最優(yōu)結(jié)果執(zhí)行。

1.7 活菌數(shù)量的測(cè)定

采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)量[10]。取1 mL發(fā)酵好的菌液稀釋至10-6、10-7、10-8倍，取1 mL稀釋液于無(wú)菌平板，然后加入適量瓊脂培養(yǎng)基搖勻，待培養(yǎng)基凝固后，在適宜溫度下倒置培養(yǎng)24 h，查出平板菌落數(shù)，測(cè)數(shù)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。根據(jù)公式：每毫升活菌數(shù)=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)，來(lái)計(jì)算發(fā)酵液中活菌總量。

枯草芽孢桿菌活菌數(shù)量的測(cè)定為：將發(fā)酵液置于80 ℃水浴鍋中20 min，此后操作同平板菌落計(jì)數(shù)法，測(cè)數(shù)培養(yǎng)基采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃有氧培養(yǎng)；酵母菌測(cè)定采用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(含氯霉素)，培養(yǎng)條件為28 ℃有氧培養(yǎng)；乳酸菌測(cè)數(shù)培養(yǎng)基采用莫匹羅星鋰鹽MRS瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃厭氧培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種接種順序?qū)w生長(zhǎng)的影響

由表2所示，按1、2組的菌種接種順序，3種益生菌均能正常生長(zhǎng)，按其他4組接種順序，枯草芽孢桿菌不能生長(zhǎng)。試驗(yàn)開(kāi)始，按照表1的接種順序，各組分別接種枯草芽孢桿菌(1、2組)、酵母菌(3、4組)和乳酸菌(5、6組)，培養(yǎng)24 h后，各組中菌體均能生長(zhǎng)。pH值以枯草芽孢桿菌組最高，分別為5.85和5.84；酵母菌組次之，pH值均為5.63；乳酸菌組最低，pH值分別為4.08和4.09。各組在24 h時(shí)分別接入相應(yīng)菌種(表1)，培養(yǎng)24 h后，1、5組(酵母菌)和2、4組(乳酸菌)接入的菌種均能正常生長(zhǎng)，以上各組pH值分別為4.75、3.96、4.14、4.75；3、6組(枯草芽孢桿菌)接入的菌種未生長(zhǎng)，pH值分別為5.32和4.02。各組在48 h時(shí)接入相應(yīng)菌種(表1)，培養(yǎng)24 h后，4、5組(枯草芽孢桿菌)未生長(zhǎng)，其他各組接種的菌種正常生長(zhǎng)，終末菌液均呈酸性，pH值分別為4.73、4.03、4.82、4.83、3.92、3.99，乳酸菌接種順序在酵母菌之前組別(2、5、6組)的pH值低于酵母菌接種順序在乳酸菌之前的組別(1、3、4組)。由于枯草芽孢桿菌和酵母菌均為需氧菌，除溫度之外其他發(fā)酵條件一致，第1組的接種順序在制劑制備時(shí)操作方便，因此確定第1組為最佳接種順序組合。

表2 菌種接種順序?qū)w生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effect of inoculation sequence on growth of strains

注：“√”表示接種的菌種生長(zhǎng)，“-”表示接種的菌種未生長(zhǎng)。

Note：“√” indicates the growth of the inoculated strain,and “-” indicates that the inoculated strain did not grow.

2.2 復(fù)合菌種分段發(fā)酵黃芪條件對(duì)各菌種生長(zhǎng)的影響

2.2.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響 由表3所示，檢測(cè)得枯草芽孢桿菌在后續(xù)試驗(yàn)過(guò)程中活菌數(shù)量變化較??；當(dāng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí)，接種的酵母菌在培養(yǎng)后獲得的數(shù)量最高，為0.98×108cfu/mL，另外4組酵母菌數(shù)量在0.75×108～0.91×108cfu/mL，隨著枯草芽孢桿菌培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)酵母菌數(shù)量呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明延長(zhǎng)枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)時(shí)間能抑制酵母菌的生長(zhǎng)。結(jié)果表明，在枯草芽孢桿菌培養(yǎng)24 h時(shí)接種酵母菌，既能保證枯草芽孢桿菌得到充分的生長(zhǎng)，又能使酵母菌的菌體數(shù)量較高，因此，確定枯草芽孢桿菌培養(yǎng)24 h時(shí)為酵母菌的最優(yōu)接種時(shí)間。

表3 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響Tab.3 Effect of Bacillus subtilis culture time on the growth of yeast

2.2.2 接種量對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響 由表4所示，隨著酵母菌接種量的提高，培養(yǎng)后所得酵母菌數(shù)量先升高后降低，以接種量為2.0%的試驗(yàn)組酵母菌數(shù)量最高，為1.34×108cfu/mL，因此，確定酵母菌最佳接種量為2.0%。

表4 接種量對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響Tab.4 Effect of inoculating volume on the growth of yeast

2.2.3 酵母菌培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響 由表5所示，酵母菌數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)量先升高后降低，以培養(yǎng)時(shí)間為60 h時(shí)的活菌數(shù)量最高，為1.98×108cfu/mL；隨著酵母菌培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，后續(xù)接種并培養(yǎng)的乳酸菌數(shù)量先升高后降低，當(dāng)酵母菌培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，接種的乳酸菌培養(yǎng)后獲得的數(shù)量最高，為12.22×108cfu/mL。酵母菌培養(yǎng)48 h時(shí)乳酸菌數(shù)量為1.87×108cfu/mL，雖然低于酵母菌培養(yǎng)60 h時(shí)的乳酸菌數(shù)量，但考慮到此時(shí)接種所得乳酸菌的活菌數(shù)最高，且延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間增加能耗，因此，確定酵母菌培養(yǎng)48 h時(shí)為乳酸菌的最優(yōu)接種時(shí)間。

表5 酵母菌培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響Tab.5 Effect of yeast culture time on Lactobacillus growth

2.2.4 接種量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響 由表6所示，隨著乳酸菌接種量的提高，培養(yǎng)后所得乳酸菌數(shù)量先升高后降低，以接種量為0.5%的試驗(yàn)組乳酸菌數(shù)量最高，為11.48×108cfu/mL，因此，確定乳酸菌的最佳接種量為0.5%。

表6 接種量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響Tab.6 Effect of inoculating volume on the growth of Lactobacillus

2.2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響 由表7所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌數(shù)量呈降低趨勢(shì)，以培養(yǎng)時(shí)間為24 h的乳酸菌數(shù)量最高，為11.64×108cfu/mL，因此，確定乳酸菌最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

表7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響Tab.7 Effect of culture time on the growth of Lactobacillus

2.3 中試擴(kuò)大試驗(yàn)結(jié)果

由表8所示，按上述試驗(yàn)所得最優(yōu)發(fā)酵條件，調(diào)整培養(yǎng)基初始pH值為8.00，發(fā)酵罐裝液量為70%，枯草芽孢桿菌接種量為3.0%，發(fā)酵溫度為37 ℃，電機(jī)轉(zhuǎn)速為250 r/min，通氣量為0.05 m3/min；枯草芽孢桿菌培養(yǎng)24 h后，以2.0%的接種量接種酵母菌，電機(jī)轉(zhuǎn)速為250 r/min，通氣量為0.05 m3/min，于28 ℃培養(yǎng)48 h；然后，以0.5%的接種量接種乳酸菌，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。檢測(cè)發(fā)酵液中各菌種的數(shù)量如下：枯草芽孢桿菌為28.52×108cfu/mL，酵母菌為5.71×108cfu/mL，乳酸菌為9.34×108cfu/mL，終末pH值為4.55。與前期搖瓶試驗(yàn)階段相比，乳酸菌數(shù)有所降低，但枯草芽孢桿菌和酵母菌數(shù)量大幅提高，說(shuō)明本研究利用復(fù)合益生菌液態(tài)發(fā)酵黃芪的方法具有良好的可行性。

表8 中試擴(kuò)大試驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Result of pilot test

3 結(jié)論與討論

本研究表明，利用多菌種能對(duì)黃芪提取液進(jìn)行混合發(fā)酵，接種順序?yàn)榭莶菅挎邨U菌、酵母菌、乳酸菌；最優(yōu)發(fā)酵條件為：枯草芽孢桿菌以3.0%的接種量于37 ℃培養(yǎng)24 h后，以2.0%的接種量接種酵母菌，于28 ℃培養(yǎng)48 h后，再以0.5%的接種量接種乳酸菌，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h；按優(yōu)化后的發(fā)酵條件，利用發(fā)酵罐進(jìn)行中試試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌的活菌數(shù)分別為28.52×108、5.71×108、9.34×108cfu/mL，終末pH值為4.55。黃芪經(jīng)益生菌混合發(fā)酵后，其作用效果與發(fā)酵之前或單一菌種發(fā)酵相比是否會(huì)有所提高，還需進(jìn)一步研究。

3.1 分段復(fù)合發(fā)酵中菌種接種順序?qū)Ω骶N生長(zhǎng)的影響

目前，關(guān)于多菌種復(fù)合發(fā)酵制備飼料添加劑或發(fā)酵型飼料原料的研究主要集中在利用同類(lèi)菌種的混合發(fā)酵，由于同類(lèi)菌種生長(zhǎng)繁殖條件相似，混合發(fā)酵培養(yǎng)可行性強(qiáng)，通過(guò)同類(lèi)多菌種混合發(fā)酵能有效提高發(fā)酵液中活菌數(shù)量或發(fā)酵底物的品質(zhì)。例如，王玉燕等[11]利用3株乳酸菌混合發(fā)酵制備具有高活菌含量的發(fā)酵液，通過(guò)發(fā)酵條件和培養(yǎng)基的優(yōu)化，活菌數(shù)量可達(dá)到1.8×1013cfu/mL。利用不同種類(lèi)的有益菌混合發(fā)酵亦有報(bào)道，李祖旭[12]用枯草芽孢桿菌、米曲霉、鼠李糖乳桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵健胃消食片藥渣得到的制劑，對(duì)脾虛小鼠腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用；王國(guó)強(qiáng)等[13]利用異常漢遜酵母菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌,以2∶2∶1的比例，5%的接種量，發(fā)酵豆粕48 h，明顯提高了豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。由于不同種類(lèi)的菌種發(fā)酵條件和營(yíng)養(yǎng)需求不一致，如果在相同的發(fā)酵條件下，將不同種類(lèi)的菌種同時(shí)接種至同一培養(yǎng)基中，再加上菌種在生長(zhǎng)過(guò)程中可能產(chǎn)生相互抑制，將會(huì)導(dǎo)致某些菌種生長(zhǎng)不充分甚至無(wú)法生長(zhǎng)。肖萌[13]利用納豆芽孢桿菌和乳酸菌分段接種的方法混合發(fā)酵菜籽粕，首先接種納豆芽孢桿菌，2 d后再接種短乳桿菌，再發(fā)酵2 d，通過(guò)成分檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，菜籽粕經(jīng)發(fā)酵后粗蛋白、粗脂肪及總氨基酸等含量顯著升高，植酸和單寧含量顯著降低，整體營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到提升。

本研究選用營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜的玉米、麩皮和豆粕混合物作為發(fā)酵黃芪提取液的培養(yǎng)基原料，能減少因營(yíng)養(yǎng)需求不同對(duì)菌種生長(zhǎng)造成的不利影響。接種方式采用分段接種，能夠避免因發(fā)酵條件不同導(dǎo)致的菌體生長(zhǎng)受阻，例如枯草芽孢桿菌和酵母菌在有氧條件下能大量繁殖，而乳酸菌則要求微需氧或厭氧條件。因此，接種順序直接決定了黃芪發(fā)酵液中益生菌的種類(lèi)和數(shù)量。試驗(yàn)中1、2組首先接種枯草芽孢桿菌，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)pH值接近6.00，后續(xù)按不同順序接種酵母菌和乳酸菌均能生長(zhǎng)；3—6組首先接種酵母菌或乳酸菌，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)pH值大約在4.00～5.50，后續(xù)培養(yǎng)枯草芽孢桿菌均不能正常繁殖，與史洪濤[14]研究結(jié)果相一致，推測(cè)培養(yǎng)基呈酸性可能是枯草芽孢桿菌不能正常繁殖的主要原因之一。此外，各菌種的代謝產(chǎn)物是否對(duì)其他菌種的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制或促進(jìn)作用，還有待深入研究。

3.2 復(fù)合菌種分段發(fā)酵條件對(duì)各菌種生長(zhǎng)的影響

發(fā)酵條件是影響發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素，相關(guān)研究表明，適宜的發(fā)酵條件包括發(fā)酵溫度、接種量、接種順序、pH值、含水量(固態(tài)發(fā)酵)等，能提高發(fā)酵產(chǎn)物中菌體數(shù)量，有利于目標(biāo)代謝產(chǎn)物的積累，并且能降低發(fā)酵底物中有害物質(zhì)的含量，進(jìn)而提高發(fā)酵制劑品質(zhì)和臨床應(yīng)用效果[15-19]。本研究將發(fā)酵菌種按一定的順序接種至含有黃芪提取液的培養(yǎng)基中，由于微生物之間的相互作用關(guān)系比較復(fù)雜，混合培養(yǎng)能造成菌種之間的空間和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，一方面能提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，另一方面也可能造成不同菌種之間在生長(zhǎng)繁殖方面的協(xié)同或拮抗作用。在搖瓶試驗(yàn)階段，枯草芽孢桿菌和酵母菌受到供氧條件的限制，但在中試擴(kuò)大試驗(yàn)時(shí)，獲得充足氧氣的枯草芽孢桿菌和酵母菌，在培養(yǎng)后活菌數(shù)量大幅提升。由此推斷，由枯草芽孢桿菌和酵母菌活菌數(shù)量的增加所產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)或菌體之間的抑制作用，可能是降低乳酸菌數(shù)量的原因。不同菌種之間產(chǎn)酶具有互補(bǔ)性，某些中藥大分子或前體成分經(jīng)微生物酶系轉(zhuǎn)化后生成次級(jí)代謝產(chǎn)物具有更強(qiáng)的生物活性[20]，因此，在保證各菌種能夠生長(zhǎng)的情況下，通過(guò)調(diào)整不同菌種的發(fā)酵時(shí)間和接種量，降低菌種之間因生長(zhǎng)拮抗產(chǎn)生的不利影響，提高每個(gè)種類(lèi)菌體的數(shù)量，能使復(fù)合菌種發(fā)酵的酶系更有利于黃芪成分的生物轉(zhuǎn)化。