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    復(fù)合益生菌液態(tài)發(fā)酵黃芪的制備方法

    2019-01-29 05:12:38,,,,,,
    河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年1期
    關(guān)鍵詞:枯草酵母菌芽孢

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    (1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院,河南 鄭州 450046; 2.鄭州市益生菌發(fā)酵中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450046;3.河南省益生菌生物轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州 450046; 4.河南省微生物生物轉(zhuǎn)化中藥工程實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450046; 5.鄭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心,河南 鄭州 450007)

    中草藥是目前公認(rèn)的綠色飼料添加劑,其在增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力、抗菌、抗病毒等方面具有良好的作用效果[1-2]。但是中草藥在臨床應(yīng)用中也存在一定缺點(diǎn),如添加量較大、適口性較差、成本較高等,對(duì)其在動(dòng)物生產(chǎn)上的推廣與應(yīng)用產(chǎn)生了不利的影響。常作為飼料添加劑的益生菌如枯草芽孢桿菌、乳酸菌等,具有增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力、調(diào)整腸道菌群平衡、維持腸黏膜完整性及提高腸道消化吸收功能的作用[3-4]。結(jié)合現(xiàn)代微生物發(fā)酵工程技術(shù),利用益生菌對(duì)中草藥進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化是對(duì)中草藥炮制方法的創(chuàng)新,該技術(shù)能提高中草藥的臨床應(yīng)用效果,主要表現(xiàn)在減少用藥劑量、提高有效成分作用速率以及具有多功能性等,并且能降低某些藥物的毒副作用[5]。一方面,中草藥黃芪在提高動(dòng)物機(jī)體免疫力、抗應(yīng)激和抗氧化能力方面具有良好的作用效果,并且對(duì)枯草芽孢桿菌和乳酸菌等益生菌的體外增殖具有良好的促進(jìn)作用;另一方面,黃芪經(jīng)益生菌發(fā)酵后臨床效果得到加強(qiáng),用量減小的同時(shí),提高了臨床應(yīng)用價(jià)值[6-7]。目前,關(guān)于發(fā)酵黃芪制劑的開(kāi)發(fā)研究,主要集中于利用1種或1類(lèi)益生菌對(duì)黃芪進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,多菌種混合發(fā)酵研究較少。本研究利用枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌對(duì)黃芪進(jìn)行分段復(fù)合發(fā)酵,旨在增強(qiáng)益生菌對(duì)黃芪生物轉(zhuǎn)化的效果,發(fā)揮多菌種協(xié)同作用,加強(qiáng)復(fù)合益生菌黃芪發(fā)酵制劑的多功能特性,提高其臨床應(yīng)用效果。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料及主要儀器

    試驗(yàn)用黃芪飲片購(gòu)于亳州藥材市場(chǎng);枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌菌種由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院發(fā)酵中藥實(shí)驗(yàn)室保存;營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、莫匹羅星鋰鹽MRS培養(yǎng)基均購(gòu)于北京澳博星生物技術(shù)有限公司;馬鈴薯液體、瓊脂培養(yǎng)基(含氯霉素)均購(gòu)于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于寧波萊??萍加邢薰荆缓銣?fù)u床購(gòu)于天津路業(yè)實(shí)驗(yàn)儀器公司;電子天平購(gòu)于鄭州通渠商貿(mào)有限公司;200 L全自動(dòng)發(fā)酵罐購(gòu)于鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司。

    1.2 菌種活化

    將枯草芽孢桿菌、酵母菌及乳酸菌菌種的甘油凍存管置于室溫,融化后用無(wú)菌接種環(huán)挑取少量菌種分別劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂(含氯霉素)培養(yǎng)基和莫匹羅星鋰鹽MRS瓊脂培養(yǎng)基,分別在37、28、37 ℃倒置培養(yǎng)24 h,然后將其轉(zhuǎn)接至相應(yīng)液體培養(yǎng)基,適宜條件下培養(yǎng)24 h后備用。

    1.3 黃芪提取液的制備

    準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的黃芪飲片,分別加5、4、4倍量的水,煮沸3次,每次約40 min,分別留取每次濾液,最后合并3次濾液并濃縮至黃芪質(zhì)量濃度為0.5 g/mL,保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 黃芪添加量、發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件

    黃芪提取液的添加量為:每毫升培養(yǎng)基中含黃芪0.5 g。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:每100 mL培養(yǎng)基中含黃芪50.0 g、豆粕2.0 g、玉米2.0 g、麩皮2.5 g;培養(yǎng)基初始pH值均為8.00,裝液量均為100 mL(500 mL三角瓶)[8]??莶菅挎邨U菌、酵母菌和乳酸菌發(fā)酵溫度分別為37、28、37 ℃,乳酸菌靜置培養(yǎng),枯草芽孢桿菌和酵母菌置恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速160 r/min培養(yǎng)。

    1.5 復(fù)合菌種分段發(fā)酵黃芪條件測(cè)定

    1.5.1 菌種接種順序?qū)w生長(zhǎng)的影響 取制備好的培養(yǎng)基18瓶,隨機(jī)分為1—6組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)3瓶。按表1所示順序組合將菌種分別在一定的時(shí)間點(diǎn)按1.0%的接種量接種至培養(yǎng)基中,接種后培養(yǎng)時(shí)間均為24 h,培養(yǎng)結(jié)束后鏡檢各菌種的生長(zhǎng)情況及pH值,接種的相應(yīng)菌種生長(zhǎng)用“√”表示,接種的相應(yīng)菌種未生長(zhǎng)用“-”表示。

    表1 菌種接種順序 Tab.1 The inoculation order of strains

    1.5.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響 采用單因子試驗(yàn)法,取制備好的培養(yǎng)基15瓶,隨機(jī)分為1—5組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)3瓶。1—5組均按3.0%接種量接入枯草芽孢桿菌[9],分別在接種后的24、36、48、60、72 h,取樣測(cè)定枯草芽孢桿菌數(shù)量,同時(shí)各組均按1.0%接種量接入酵母菌,培養(yǎng)24 h后測(cè)定酵母菌數(shù)量。

    1.5.3 酵母菌最適接種量的測(cè)定 采用單因子試驗(yàn)法,取制備好的培養(yǎng)基15瓶,隨機(jī)分為1—5組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)3瓶。1—5組均按3.0%接種量接入枯草芽孢桿菌,按1.5.2中所得最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)后,各組分別按0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的接種量接入酵母菌,培養(yǎng)24 h后測(cè)定酵母菌的數(shù)量。

    1.5.4 酵母菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響 采用單因子試驗(yàn)法,取制備好的培養(yǎng)基15瓶,隨機(jī)分為1—5組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)3瓶。1—5組均按3.0%的接種量接入枯草芽孢桿菌,按照1.5.2中所得最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng),然后均按1.5.3中所得最佳接種量接入酵母菌,分別在接種后的24、36、48、60、72 h,取樣并測(cè)定酵母菌數(shù)量,同時(shí)各組均按1.0%的接種量接入乳酸菌,培養(yǎng)24 h后測(cè)定乳酸菌數(shù)量。

    1.5.5 乳酸菌最適接種量的測(cè)定 采用單因子試驗(yàn)法,取制備好的培養(yǎng)基15瓶,隨機(jī)分為1—5組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)3瓶。1—5組均按3.0%的接種量接入枯草芽孢桿菌,按照1.5.2中所得最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng),然后均按1.5.3中所得最佳接種量接入酵母菌,再按照1.5.4中所得最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)后,各組分別按0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的接種量接入乳酸菌,培養(yǎng)24 h后測(cè)定乳酸菌的數(shù)量。

    1.5.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響 采用單因子試驗(yàn)法,取制備好的培養(yǎng)基15瓶,隨機(jī)分為1—5組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)3瓶。1—5組均按3.0%的接種量接入枯草芽孢桿菌,按照1.5.2中所得最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng),然后均按1.5.3中所得最佳接種量接入酵母菌,再按照1.5.4中所得最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng),最后各組均按1.5.5中所得最佳接種量接入乳酸菌,分別在培養(yǎng)24、36、48、60、72 h時(shí),取樣并測(cè)定乳酸菌數(shù)量。

    1.6 中試擴(kuò)大試驗(yàn)

    為進(jìn)一步確定上述搖瓶試驗(yàn)結(jié)果的實(shí)用性,利用200 L全自動(dòng)不銹鋼發(fā)酵罐及篩選后的培養(yǎng)基進(jìn)行中試擴(kuò)大試驗(yàn),并檢測(cè)發(fā)酵液各菌種的數(shù)量和發(fā)酵終點(diǎn)pH值。培養(yǎng)基初始pH值為8.00,裝液量為70%;枯草芽孢桿菌發(fā)酵溫度為37 ℃,接種量為3.0%,電機(jī)轉(zhuǎn)速為250 r/min,通氣量為0.05 m3/min;酵母菌發(fā)酵溫度為28 ℃,電機(jī)轉(zhuǎn)速為250 r/min,通氣量為0.05 m3/min;其他發(fā)酵條件按照1.5中所得的最優(yōu)結(jié)果執(zhí)行。

    1.7 活菌數(shù)量的測(cè)定

    采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)量[10]。取1 mL發(fā)酵好的菌液稀釋至10-6、10-7、10-8倍,取1 mL稀釋液于無(wú)菌平板,然后加入適量瓊脂培養(yǎng)基搖勻,待培養(yǎng)基凝固后,在適宜溫度下倒置培養(yǎng)24 h,查出平板菌落數(shù),測(cè)數(shù)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。根據(jù)公式:每毫升活菌數(shù)=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù),來(lái)計(jì)算發(fā)酵液中活菌總量。

    枯草芽孢桿菌活菌數(shù)量的測(cè)定為:將發(fā)酵液置于80 ℃水浴鍋中20 min,此后操作同平板菌落計(jì)數(shù)法,測(cè)數(shù)培養(yǎng)基采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為37 ℃有氧培養(yǎng);酵母菌測(cè)定采用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(含氯霉素),培養(yǎng)條件為28 ℃有氧培養(yǎng);乳酸菌測(cè)數(shù)培養(yǎng)基采用莫匹羅星鋰鹽MRS瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為37 ℃厭氧培養(yǎng)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌種接種順序?qū)w生長(zhǎng)的影響

    由表2所示,按1、2組的菌種接種順序,3種益生菌均能正常生長(zhǎng),按其他4組接種順序,枯草芽孢桿菌不能生長(zhǎng)。試驗(yàn)開(kāi)始,按照表1的接種順序,各組分別接種枯草芽孢桿菌(1、2組)、酵母菌(3、4組)和乳酸菌(5、6組),培養(yǎng)24 h后,各組中菌體均能生長(zhǎng)。pH值以枯草芽孢桿菌組最高,分別為5.85和5.84;酵母菌組次之,pH值均為5.63;乳酸菌組最低,pH值分別為4.08和4.09。各組在24 h時(shí)分別接入相應(yīng)菌種(表1),培養(yǎng)24 h后,1、5組(酵母菌)和2、4組(乳酸菌)接入的菌種均能正常生長(zhǎng),以上各組pH值分別為4.75、3.96、4.14、4.75;3、6組(枯草芽孢桿菌)接入的菌種未生長(zhǎng),pH值分別為5.32和4.02。各組在48 h時(shí)接入相應(yīng)菌種(表1),培養(yǎng)24 h后,4、5組(枯草芽孢桿菌)未生長(zhǎng),其他各組接種的菌種正常生長(zhǎng),終末菌液均呈酸性,pH值分別為4.73、4.03、4.82、4.83、3.92、3.99,乳酸菌接種順序在酵母菌之前組別(2、5、6組)的pH值低于酵母菌接種順序在乳酸菌之前的組別(1、3、4組)。由于枯草芽孢桿菌和酵母菌均為需氧菌,除溫度之外其他發(fā)酵條件一致,第1組的接種順序在制劑制備時(shí)操作方便,因此確定第1組為最佳接種順序組合。

    表2 菌種接種順序?qū)w生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effect of inoculation sequence on growth of strains

    注:“√”表示接種的菌種生長(zhǎng),“-”表示接種的菌種未生長(zhǎng)。

    Note:“√” indicates the growth of the inoculated strain,and “-” indicates that the inoculated strain did not grow.

    2.2 復(fù)合菌種分段發(fā)酵黃芪條件對(duì)各菌種生長(zhǎng)的影響

    2.2.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響 由表3所示,檢測(cè)得枯草芽孢桿菌在后續(xù)試驗(yàn)過(guò)程中活菌數(shù)量變化較??;當(dāng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí),接種的酵母菌在培養(yǎng)后獲得的數(shù)量最高,為0.98×108cfu/mL,另外4組酵母菌數(shù)量在0.75×108~0.91×108cfu/mL,隨著枯草芽孢桿菌培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)酵母菌數(shù)量呈下降趨勢(shì),說(shuō)明延長(zhǎng)枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)時(shí)間能抑制酵母菌的生長(zhǎng)。結(jié)果表明,在枯草芽孢桿菌培養(yǎng)24 h時(shí)接種酵母菌,既能保證枯草芽孢桿菌得到充分的生長(zhǎng),又能使酵母菌的菌體數(shù)量較高,因此,確定枯草芽孢桿菌培養(yǎng)24 h時(shí)為酵母菌的最優(yōu)接種時(shí)間。

    表3 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響Tab.3 Effect of Bacillus subtilis culture time on the growth of yeast

    2.2.2 接種量對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響 由表4所示,隨著酵母菌接種量的提高,培養(yǎng)后所得酵母菌數(shù)量先升高后降低,以接種量為2.0%的試驗(yàn)組酵母菌數(shù)量最高,為1.34×108cfu/mL,因此,確定酵母菌最佳接種量為2.0%。

    表4 接種量對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響Tab.4 Effect of inoculating volume on the growth of yeast

    2.2.3 酵母菌培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響 由表5所示,酵母菌數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),活菌數(shù)量先升高后降低,以培養(yǎng)時(shí)間為60 h時(shí)的活菌數(shù)量最高,為1.98×108cfu/mL;隨著酵母菌培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),后續(xù)接種并培養(yǎng)的乳酸菌數(shù)量先升高后降低,當(dāng)酵母菌培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí),接種的乳酸菌培養(yǎng)后獲得的數(shù)量最高,為12.22×108cfu/mL。酵母菌培養(yǎng)48 h時(shí)乳酸菌數(shù)量為1.87×108cfu/mL,雖然低于酵母菌培養(yǎng)60 h時(shí)的乳酸菌數(shù)量,但考慮到此時(shí)接種所得乳酸菌的活菌數(shù)最高,且延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間增加能耗,因此,確定酵母菌培養(yǎng)48 h時(shí)為乳酸菌的最優(yōu)接種時(shí)間。

    表5 酵母菌培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響Tab.5 Effect of yeast culture time on Lactobacillus growth

    2.2.4 接種量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響 由表6所示,隨著乳酸菌接種量的提高,培養(yǎng)后所得乳酸菌數(shù)量先升高后降低,以接種量為0.5%的試驗(yàn)組乳酸菌數(shù)量最高,為11.48×108cfu/mL,因此,確定乳酸菌的最佳接種量為0.5%。

    表6 接種量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響Tab.6 Effect of inoculating volume on the growth of Lactobacillus

    2.2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響 由表7所示,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸菌數(shù)量呈降低趨勢(shì),以培養(yǎng)時(shí)間為24 h的乳酸菌數(shù)量最高,為11.64×108cfu/mL,因此,確定乳酸菌最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

    表7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響Tab.7 Effect of culture time on the growth of Lactobacillus

    2.3 中試擴(kuò)大試驗(yàn)結(jié)果

    由表8所示,按上述試驗(yàn)所得最優(yōu)發(fā)酵條件,調(diào)整培養(yǎng)基初始pH值為8.00,發(fā)酵罐裝液量為70%,枯草芽孢桿菌接種量為3.0%,發(fā)酵溫度為37 ℃,電機(jī)轉(zhuǎn)速為250 r/min,通氣量為0.05 m3/min;枯草芽孢桿菌培養(yǎng)24 h后,以2.0%的接種量接種酵母菌,電機(jī)轉(zhuǎn)速為250 r/min,通氣量為0.05 m3/min,于28 ℃培養(yǎng)48 h;然后,以0.5%的接種量接種乳酸菌,于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。檢測(cè)發(fā)酵液中各菌種的數(shù)量如下:枯草芽孢桿菌為28.52×108cfu/mL,酵母菌為5.71×108cfu/mL,乳酸菌為9.34×108cfu/mL,終末pH值為4.55。與前期搖瓶試驗(yàn)階段相比,乳酸菌數(shù)有所降低,但枯草芽孢桿菌和酵母菌數(shù)量大幅提高,說(shuō)明本研究利用復(fù)合益生菌液態(tài)發(fā)酵黃芪的方法具有良好的可行性。

    表8 中試擴(kuò)大試驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Result of pilot test

    3 結(jié)論與討論

    本研究表明,利用多菌種能對(duì)黃芪提取液進(jìn)行混合發(fā)酵,接種順序?yàn)榭莶菅挎邨U菌、酵母菌、乳酸菌;最優(yōu)發(fā)酵條件為:枯草芽孢桿菌以3.0%的接種量于37 ℃培養(yǎng)24 h后,以2.0%的接種量接種酵母菌,于28 ℃培養(yǎng)48 h后,再以0.5%的接種量接種乳酸菌,于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h;按優(yōu)化后的發(fā)酵條件,利用發(fā)酵罐進(jìn)行中試試驗(yàn),發(fā)酵結(jié)束時(shí),枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌的活菌數(shù)分別為28.52×108、5.71×108、9.34×108cfu/mL,終末pH值為4.55。黃芪經(jīng)益生菌混合發(fā)酵后,其作用效果與發(fā)酵之前或單一菌種發(fā)酵相比是否會(huì)有所提高,還需進(jìn)一步研究。

    3.1 分段復(fù)合發(fā)酵中菌種接種順序?qū)Ω骶N生長(zhǎng)的影響

    目前,關(guān)于多菌種復(fù)合發(fā)酵制備飼料添加劑或發(fā)酵型飼料原料的研究主要集中在利用同類(lèi)菌種的混合發(fā)酵,由于同類(lèi)菌種生長(zhǎng)繁殖條件相似,混合發(fā)酵培養(yǎng)可行性強(qiáng),通過(guò)同類(lèi)多菌種混合發(fā)酵能有效提高發(fā)酵液中活菌數(shù)量或發(fā)酵底物的品質(zhì)。例如,王玉燕等[11]利用3株乳酸菌混合發(fā)酵制備具有高活菌含量的發(fā)酵液,通過(guò)發(fā)酵條件和培養(yǎng)基的優(yōu)化,活菌數(shù)量可達(dá)到1.8×1013cfu/mL。利用不同種類(lèi)的有益菌混合發(fā)酵亦有報(bào)道,李祖旭[12]用枯草芽孢桿菌、米曲霉、鼠李糖乳桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵健胃消食片藥渣得到的制劑,對(duì)脾虛小鼠腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用;王國(guó)強(qiáng)等[13]利用異常漢遜酵母菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌,以2∶2∶1的比例,5%的接種量,發(fā)酵豆粕48 h,明顯提高了豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。由于不同種類(lèi)的菌種發(fā)酵條件和營(yíng)養(yǎng)需求不一致,如果在相同的發(fā)酵條件下,將不同種類(lèi)的菌種同時(shí)接種至同一培養(yǎng)基中,再加上菌種在生長(zhǎng)過(guò)程中可能產(chǎn)生相互抑制,將會(huì)導(dǎo)致某些菌種生長(zhǎng)不充分甚至無(wú)法生長(zhǎng)。肖萌[13]利用納豆芽孢桿菌和乳酸菌分段接種的方法混合發(fā)酵菜籽粕,首先接種納豆芽孢桿菌,2 d后再接種短乳桿菌,再發(fā)酵2 d,通過(guò)成分檢測(cè)發(fā)現(xiàn),菜籽粕經(jīng)發(fā)酵后粗蛋白、粗脂肪及總氨基酸等含量顯著升高,植酸和單寧含量顯著降低,整體營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到提升。

    本研究選用營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜的玉米、麩皮和豆粕混合物作為發(fā)酵黃芪提取液的培養(yǎng)基原料,能減少因營(yíng)養(yǎng)需求不同對(duì)菌種生長(zhǎng)造成的不利影響。接種方式采用分段接種,能夠避免因發(fā)酵條件不同導(dǎo)致的菌體生長(zhǎng)受阻,例如枯草芽孢桿菌和酵母菌在有氧條件下能大量繁殖,而乳酸菌則要求微需氧或厭氧條件。因此,接種順序直接決定了黃芪發(fā)酵液中益生菌的種類(lèi)和數(shù)量。試驗(yàn)中1、2組首先接種枯草芽孢桿菌,培養(yǎng)結(jié)束時(shí)pH值接近6.00,后續(xù)按不同順序接種酵母菌和乳酸菌均能生長(zhǎng);3—6組首先接種酵母菌或乳酸菌,培養(yǎng)結(jié)束時(shí)pH值大約在4.00~5.50,后續(xù)培養(yǎng)枯草芽孢桿菌均不能正常繁殖,與史洪濤[14]研究結(jié)果相一致,推測(cè)培養(yǎng)基呈酸性可能是枯草芽孢桿菌不能正常繁殖的主要原因之一。此外,各菌種的代謝產(chǎn)物是否對(duì)其他菌種的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制或促進(jìn)作用,還有待深入研究。

    3.2 復(fù)合菌種分段發(fā)酵條件對(duì)各菌種生長(zhǎng)的影響

    發(fā)酵條件是影響發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素,相關(guān)研究表明,適宜的發(fā)酵條件包括發(fā)酵溫度、接種量、接種順序、pH值、含水量(固態(tài)發(fā)酵)等,能提高發(fā)酵產(chǎn)物中菌體數(shù)量,有利于目標(biāo)代謝產(chǎn)物的積累,并且能降低發(fā)酵底物中有害物質(zhì)的含量,進(jìn)而提高發(fā)酵制劑品質(zhì)和臨床應(yīng)用效果[15-19]。本研究將發(fā)酵菌種按一定的順序接種至含有黃芪提取液的培養(yǎng)基中,由于微生物之間的相互作用關(guān)系比較復(fù)雜,混合培養(yǎng)能造成菌種之間的空間和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng),一方面能提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率,另一方面也可能造成不同菌種之間在生長(zhǎng)繁殖方面的協(xié)同或拮抗作用。在搖瓶試驗(yàn)階段,枯草芽孢桿菌和酵母菌受到供氧條件的限制,但在中試擴(kuò)大試驗(yàn)時(shí),獲得充足氧氣的枯草芽孢桿菌和酵母菌,在培養(yǎng)后活菌數(shù)量大幅提升。由此推斷,由枯草芽孢桿菌和酵母菌活菌數(shù)量的增加所產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)或菌體之間的抑制作用,可能是降低乳酸菌數(shù)量的原因。不同菌種之間產(chǎn)酶具有互補(bǔ)性,某些中藥大分子或前體成分經(jīng)微生物酶系轉(zhuǎn)化后生成次級(jí)代謝產(chǎn)物具有更強(qiáng)的生物活性[20],因此,在保證各菌種能夠生長(zhǎng)的情況下,通過(guò)調(diào)整不同菌種的發(fā)酵時(shí)間和接種量,降低菌種之間因生長(zhǎng)拮抗產(chǎn)生的不利影響,提高每個(gè)種類(lèi)菌體的數(shù)量,能使復(fù)合菌種發(fā)酵的酶系更有利于黃芪成分的生物轉(zhuǎn)化。

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