響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助提取藍(lán)靛果花色苷工藝及其抗氧化活性

李鳳鳳,張秀玲,*,柳曉晨,張雪婷,趙恒田

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030;2.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,黑龍江哈爾濱 150081)

藍(lán)靛果忍冬(LoniceraedulisTurcz)又名藍(lán)靛果,俗稱山茄子、黑瞎子果等,屬于忍冬科忍冬屬,是一種新興的野生漿果資源[1-5]。藍(lán)靛果果實中VC含量高于其他一般果蔬,且有多種有益的礦物質(zhì)和氨基酸,特別是花色苷含量顯著高于其他果實(藍(lán)莓等)[6-7],具有抗氧化功能,對癌癥、心血管、高血壓等多種慢性疾病有預(yù)防作用[8-10],營養(yǎng)和保健價值較高,因此有“第三代水果”之稱[11-12]?；ㄉ帐腔ㄉ嘏c糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物,廣泛存在于果蔬中,使其呈現(xiàn)由紅、紫紅到蘭等不同顏色。研究表明,花色苷具有多種生理保健功能,包括抗氧化、清除自由基、抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病以及預(yù)防老年癡呆等,因此提取花青素可以滿足食品工業(yè)的日益增長的需求及其在醫(yī)藥和紡織工業(yè)中的重要應(yīng)用。

目前已有通過使用有機溶劑、酶輔助提取、超臨界流體萃取和超聲輔助提取等方法提取藍(lán)靛果中的花色苷,與常規(guī)方法比較提取量提高[13-18]。應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)靛果花色苷微波輔助提取與抗氧化性的研究少有報道。

本文采用微波輔助提取法提取藍(lán)靛果中的花色苷,相較于普通的溶劑提取法,具有時間短、提取效率高、成本適中等優(yōu)點;相較于酶解法,具有操作簡單、能夠更好地保護藍(lán)靛果中的花色苷成分的優(yōu)點;相較于超聲波輔助提取,具有耗時短、無噪音的優(yōu)點。通過響應(yīng)面法進行優(yōu)化,能夠評估多個參數(shù)及其相互作用對響應(yīng)值的影響,確定出最佳提取工藝條件,并且分析了其體外抗氧化活性,為更深的研究和開發(fā)藍(lán)靛果花色苷提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生藍(lán)靛果 采自小興安嶺伊春地區(qū)的野生鮮果,挑選新鮮無損傷果、除去雜質(zhì)后進行速凍貯藏(-20 ℃);無水乙醇、鹽酸、氯化鉀、乙酸鈉等 哈爾濱盛達生化儀器有限公司;1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(含10～20%苯) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽 美國sigma公司。

MJ-BL25C3攪拌機 廣東美的精品電器制造有限公司;JA1003電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C型pH計 上海雷磁儀器廠;G70D20CN1P-D2(S0)格蘭仕微波爐 廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司;UV-2600紫外可見分光光度計 日本島津公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍(lán)靛果花色苷的提取 取適量藍(lán)靛果凍果于室溫下解凍,用攪拌機將其破碎成勻漿。精確稱取5.00 g藍(lán)靛果凍果勻漿,加入錐形瓶中,按照一定的料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液,設(shè)定相應(yīng)的微波提取功率和提取時間,進行微波輔助提取。將提取液抽濾,得到花色苷粗提取液。

1.2.2 藍(lán)靛果花色苷提取單因素實驗

1.2.2.1 微波功率的優(yōu)化 準(zhǔn)確稱取5.00 g 的藍(lán)靛果勻漿6份,分別按料液比1∶20 g/mL 加入70%乙醇溶液,在微波功率為70、140、210、280、350、420 W的實驗條件下提取 90 s,提取液抽濾并計算花色苷提取量,平行實驗三次。

1.2.2.2 微波時間的優(yōu)化 準(zhǔn)確稱取5.00 g 的藍(lán)靛果勻漿6份,分別按料液比1∶20 g/mL加入 70% 乙醇溶液,在微波功率為280 W的實驗條件下依次提取30、60、90、120、150、180 s,提取液抽濾并計算花色苷提取量,平行實驗三次。

1.2.2.3 料液比的優(yōu)化 準(zhǔn)確稱取5.00 g 的藍(lán)靛果勻漿6份,分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL 加入 70% 乙醇溶液,在微波功率為280 W,微波時間90 s的實驗條件下提取,提取液抽濾并計算花色苷提取量,平行實驗三次。

1.2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化 準(zhǔn)確稱取5.00 g 的藍(lán)靛果勻漿6份,分別按料液比1∶20 g/mL 加入體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液,在微波功率為280 W,微波時間90 s的實驗條件下提取,提取液抽濾并計算花色苷提取量,平行實驗三次。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計 根據(jù)上述各個單因素的實驗結(jié)果,以藍(lán)靛果花色苷提取量為響應(yīng)值,進行響應(yīng)面分析,得到最優(yōu)的工藝條件。響應(yīng)面實驗因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.2.4 藍(lán)靛果中花色苷提取量的測定 采用pH示差法[19-20]。取2份2 mL的花色苷提取液,分別用pH1.0(將濃度均為0.2 mol/L和氯化鉀溶液以67∶25比例混勻后校正)和pH4.5(將濃度均為0.2 mol/L的乙酸溶液和乙酸鈉溶液等體積混勻后校正)緩沖溶液,定容至50 mL,平衡60 min,在540 nm下測定吸光值,按式下式計算提取量:

式中:A:(A540-A700)pH1.0-(A540-A700)pH4.5;MW:矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量,g/mol,449.29;DF:稀釋倍數(shù);V:提取溶劑的體積,mL;ε:矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù),L·mol/cm,26900;m:稱取的藍(lán)靛果質(zhì)量;1:比色皿的光距長度,cm。

1.2.5 DPPH自由基清除的能力測定 參照李新原等[21]的方法進行改動。取不同質(zhì)量濃度(20、40、60、80、100 μg/mL)的藍(lán)靛果花色苷提取液2.0 mL與0.1 mol/L DPPH乙醇溶液2.0 mL混合均勻,然后將其在室溫下放置30 min后,在517 nm波長處測吸光值A(chǔ)1;用無水乙醇代替藍(lán)靛果花色苷提取液和DPPH乙醇溶液,按照同樣的方法,測定吸光值A(chǔ)0、A2。采用相對應(yīng)濃度的VC作為花色苷提取液的對照,平行測定3次。DPPH自由基清除率按下式計算:

1.2.6 ABTS+·清除能力的測定 參照蔡寧晨等[22]的方法略做改動。首先配置ABTS+·母液:將88 μL(140 mmol/L)氧化劑過硫酸鉀溶液與5 mL的7 mmol/L ABTS+·溶液混合,在室溫避光條件下靜置過夜。然后用無水乙醇將ABTS+·母液稀釋,使其在734 nm波長處吸光度為0.7±0.02。取不同質(zhì)量濃度(20、40、60、80、100 μg/mL)的藍(lán)靛果花色苷提取液0.1 mL與3.9 mL ABTS+·工作液充分混勻,在室溫黑暗處反應(yīng)10 min后,在734 nm波長處測定吸光值A(chǔ)1。以無水乙醇替換藍(lán)靛果花色苷提取液,同法操作,測定吸光值A(chǔ)2。用相對應(yīng)濃度的VC作為花色苷提取液的對照,平行測定3次。ABTS+·清除率按下式計算:

1.2.7 超氧陰離子自由基清除能力的測定 參照李斌等[23]的方法略做改動。取0.2 mL不同質(zhì)量濃度(20、40、60、80、100 μg/mL)的藍(lán)靛果花色苷提取液,依次加入5.7 mL Tris-HCl緩沖溶液(50 mmol/L,pH8.20)、0.1 mL的6 mmol/L鄰苯三酚溶液,混勻后室溫下反應(yīng)5 min,加入1滴HCl(12 mol/L)來結(jié)束反應(yīng),最后在320 nm波長處測定吸光值A(chǔ)1。按照同一方法,以蒸餾水分別代替鄰苯三酚溶液和提取液進行反應(yīng),測定吸光值A(chǔ)2、A0。用相對應(yīng)濃度的VC作為花色苷提取液的對照,平行測定3次。超氧陰離子自由基清除率按下式計算:

1.2.8 總還原能力的測定 采用鐵氰化鉀還原顯色法[24]。取0.2 mL不同質(zhì)量濃度(20、40、60、80、100 μg/mL)的藍(lán)靛果花色苷提取液于試管中,分別加入1.0 mL的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和1.0 mL 1%(w/v)鐵氰化鉀溶液,旋渦震蕩混勻,然后置于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min,取出后加入1.0 mL 10%(w/v)三氯乙酸溶液終止反應(yīng),3000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清液2.0 mL,依次加入2.0 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%(w/v)FeCl3溶液,混勻后放置15 min后,在波長700 nm下測定吸光值A(chǔ)1,用蒸餾水代替提取液,測定吸光值A(chǔ)2。采用相對應(yīng)濃度的VC作為對照,每組實驗平行3次?？傔€原力按下式計算:

還原力=A1-A2

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有實驗平行3次。采用Origin 8.0軟件、SPSS 22.0軟件和Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件進行實驗設(shè)計和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助提取藍(lán)靛果花色苷的單因素實驗結(jié)果

2.1.1 微波功率對藍(lán)靛果花色苷提取量的影響 微波功率對藍(lán)靛果花色苷提取量的影響見圖1,由圖1可知,微波功率在70～280 W的范圍內(nèi),隨著功率的增加,藍(lán)靛果花色苷提取量增加,不同微波功率之間藍(lán)靛果花色苷提取量存在顯著性差異(p<0.05)。當(dāng)微波功率為280 W時,花色苷含量達到最大值285.13 mg/100 g,繼續(xù)增大功率對花色苷提取量無顯著性影響(p>0.05),甚至出現(xiàn)下降,原因可能是微波功率增加導(dǎo)致體系溫度過高,使花色苷結(jié)構(gòu)破壞,同時有雜質(zhì)溶出,導(dǎo)致藍(lán)靛果花色苷提取量的下降。因此,選擇微波功率210～350 W作為響應(yīng)面的參數(shù)范圍。

圖1 微波功率對藍(lán)靛果花色苷提取量的影響Fig.1 Effect of microwave power on extraction amount of anthocyanins from Lonicera edulis

2.1.2 微波時間對藍(lán)靛果花色苷提取量的影響 微波時間對藍(lán)靛果花色苷提取量的影響見圖2,由圖2可知,隨著微波時間的增加,藍(lán)靛果花色苷提取量呈先上升再下降的趨勢。這可能是因為隨時間增加有利于花色苷成分充分的溶出,所以花色苷提取量增加;然而隨著時間繼續(xù)增加,花色苷發(fā)生降解,使提取量降低?；ㄉ仗崛〉淖罴盐⒉〞r間是90 s,提取量達到290.54 mg/100 g,顯著高于其他時間的提取量(p<0.05)。因此,選擇微波時間60～120 s作為響應(yīng)面的參數(shù)范圍。

圖2 微波時間對藍(lán)靛果花色苷提取量的影響Fig.2 Effect of microwave time on extraction of anthocyanin from Lonicera edulis

2.1.3 料液比對藍(lán)靛果花色苷提取量的影響 料液比對藍(lán)靛果花色苷提取量的影響見圖3,由圖3可知,在料液比1∶10～1∶25之間,藍(lán)靛果花色苷的提取量隨溶劑用量的增大而顯著增加(p<0.05),這是因為隨著溶劑用量增加,花色苷成分溶出增加;當(dāng)料液比達到1∶25時,花色苷提取量最大為280.45 mg/100 g,繼續(xù)增加溶劑用量,花色苷提取量無顯著性差異(p>0.05),隨后出現(xiàn)下降的趨勢,這是由于隨著提取劑用量增加,干擾雜質(zhì)的浸出量增加。因此,選擇料液比1∶20～1∶30作為響應(yīng)面的參數(shù)范圍。

圖3 料液比對藍(lán)靛果花色苷提取量的影響Fig.3 Effect of ratio of material to liquid on extraction of anthocyanin from Lonicera edulis

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對藍(lán)靛果花色苷提取量的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對藍(lán)靛果花色苷提取量的影響見圖4,由圖4可知,藍(lán)靛果花色苷提取量在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時,達到最大值288.83 mg/100 g。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在40～80%范圍內(nèi),藍(lán)靛果花色苷提取量呈顯著性增加(p<0.05)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于80%,花色苷含量下降。因此,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)70%～90%作為響應(yīng)面的參數(shù)范圍。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對藍(lán)靛果提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on extraction of Lonicera edulis

2.2 微波輔助提取藍(lán)靛果花色苷的響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果

表2 響應(yīng)面分析實驗方案與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2 最佳條件的確定和回歸模型的驗證 確定最佳工藝條件為微波功率304.52 W,微波時間96.93 s,料液比1∶27.62,乙醇體積分?jǐn)?shù)89.06%,在此條件下得到的花色苷提取量為301.185 mg/100 g。由于實際工藝條件的限制，選擇微波功率280 W,微波時間90 s,料液比1∶25,乙醇體積分?jǐn)?shù)85%,在這個工藝參數(shù)下,得到花色苷提取量為(292.16±1.25) mg/100 g,與理論值僅相差3%左右,表明此模型能較好地測定藍(lán)靛果中花色苷含量。

2.3 藍(lán)靛果花色苷對DPPH自由基的清除能力

由圖6可知,對于藍(lán)靛果花色苷和VC照組對DPPH自由基能較好地清除,且清除率隨質(zhì)量濃度增加而增強。當(dāng)質(zhì)量濃度在20～80 μg/mL范圍內(nèi),藍(lán)靛果花色苷對DPPH自由基的清除能力顯著性增強(p<0.05)。藍(lán)靛果花色苷和VC對照組在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時,清除DPPH自由基的能力都達到最大,清除率分別為89.2%和91.59%。

圖6 藍(lán)靛果花色苷對DPPH自由基的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of anthocyanins from Lonicera edulis on DPPH free radical

2.4 藍(lán)靛果花色苷對ABTS+·的清除能力

由圖7可知,藍(lán)靛果花色苷和VC對照組對ABTS+·的清除率隨質(zhì)量濃度增加而增加,且清除能力均較強。在同一質(zhì)量濃度下,藍(lán)靛果花色苷對ABTS+·的清除能力弱于VC對照組。當(dāng)質(zhì)量濃度在20～100 μg/mL,對ABTS+·來說,藍(lán)靛果花色苷和VC對照組清除能力存在顯著性差異(p<0.05)。藍(lán)靛果花色苷清除率在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時達到最大,為70.4%。

圖7 藍(lán)靛果花色苷對ABTS+·的清除能力Fig.7 Scavenging capacity of anthocyanins from Lonicera edulis on ABTS+·

2.5 藍(lán)靛果花色苷對超氧陰離子自由基的清除能力

由圖8可知,隨著質(zhì)量濃度的增加,清除能力增強,藍(lán)靛果花色苷和VC對照組對超氧陰離子自由基的清除能力均較顯著(p<0.05)。在同等濃度下,藍(lán)靛果花色苷對超氧陰離子自由基的清除率弱于VC對照組。當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL時,藍(lán)靛果花色苷超氧陰離子自由基的清除率為44.73%,VC對照組為64.49%。

圖8 藍(lán)靛果花色苷對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.8 Scavenging capacity of anthocyanins from Lonicera edulis on superoxide freeradical

2.6 總還原能力

由圖9可知,對于藍(lán)靛果花色苷和VC對照組來說,還原能力都隨著質(zhì)量濃度的增加而增強。在同一質(zhì)量濃度下,藍(lán)靛果花色苷的還原能力弱于VC對照組。當(dāng)質(zhì)量濃度在60～100 μg/mL,藍(lán)靛果花色苷的還原力呈顯著性上升(p<0.05)。當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL時,藍(lán)靛果花色苷的還原力達到最大為1.06,達到同等質(zhì)量濃度VC還原力的68%。

圖9 藍(lán)靛果花色苷的總還原力Fig.9 Total reduction capacity of anthocyanins from Lonicera edulis

3 結(jié)論

采用微波輔助提取藍(lán)靛果花色苷,利用響應(yīng)面法得到最佳工藝條件為微波功率280 W,微波時間90 s,料液比1∶25,乙醇體積分?jǐn)?shù)85%,在此條件下獲得的花色苷提取量為(292.16±1.25) mg/100 g。通過藍(lán)靛果花色苷的體外抗氧化活性實驗得知,藍(lán)靛果花色苷與VC對照組比,具有一定抗氧化能力。藍(lán)靛果花色苷對DPPH自由基、ABTS+·和超氧陰離子自由基具有較強的清除能力,清除率分別達到89.20%、70.40%和44.73%,同時具有較高的總還原能力。因此,進一步開發(fā)和應(yīng)用藍(lán)靛果花色苷具有重要意義。隨著人們對花色苷的興趣越來越大,花色苷對人體健康產(chǎn)生積極的有益作用,其在食品工業(yè)以及其他相關(guān)行業(yè)中的應(yīng)用前景廣闊。