基于核磁共振的代謝組學(xué)技術(shù)在肉品科學(xué)中的應(yīng)用

秦澤宇,王 浩,溫榮欣,孔保華

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)波譜分析具有高通量、重復(fù)性高、樣品處理簡單和分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),特別適用于分析食品這種復(fù)雜體系[1]。NMR按照磁體強(qiáng)度可分為高場(chǎng)核磁共振(高分辨率)和低場(chǎng)核磁共振(低分辨率)。低分辨率NMR波譜技術(shù)在國內(nèi)食品科學(xué)領(lǐng)域的研究已經(jīng)相對(duì)成熟,本文不再贅述,而高分辨率NMR由于需要配備昂貴復(fù)雜的儀器,因此高分辨率NMR波譜分析技術(shù)在國內(nèi)食品科學(xué)尤其肉品科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用并不多見[2]。代謝組學(xué)是一門交叉學(xué)科,其將分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、基因組學(xué)、表達(dá)組學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)和信息學(xué)等學(xué)科相互結(jié)合,分析組群指標(biāo)而非單一指標(biāo),借助高通量檢測(cè)和多元數(shù)據(jù)處理,具有整體觀的思路,是對(duì)所有低分子量代謝物(<1500 Da)進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)[3-4]。而基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)主要應(yīng)用于生物、醫(yī)藥尤其是中藥的研究[5]。在食品科學(xué)與工程領(lǐng)域,有學(xué)者成功將該技術(shù)應(yīng)用于食品鑒別、食品質(zhì)量控制、食品加工和貯存、預(yù)測(cè)和鑒別食品味道等方面,Fotakis[6]等利用NMR代謝組學(xué)技術(shù)鑒別了不同葡萄酒所用葡萄產(chǎn)地的不同,Ko[7]等利用此技術(shù)分析了醬油在不同陳化年份的代謝特征,Ye[8]等研究了加工對(duì)條斑紫菜產(chǎn)品的營養(yǎng)物質(zhì)組成的影響,Wei[9]等對(duì)多種咖啡豆的味道進(jìn)行了預(yù)測(cè);在肉品科學(xué)領(lǐng)域,也有學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道[10-12]。但是整體而言,基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)在肉品科學(xué)的應(yīng)用較少。

因?yàn)榛贜MR的代謝組學(xué)技術(shù)具有諸多優(yōu)點(diǎn),在食品領(lǐng)域前景寬廣。本文將從NMR以及代謝組學(xué)的基本原理、基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)的數(shù)據(jù)處理方法及其在肉品科學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述,并展望了此技術(shù)在研究動(dòng)物福利對(duì)肉品質(zhì)的影響和小分子代謝物對(duì)肉品質(zhì)影響中的應(yīng)用。

1 NMR基本原理簡介及NMR波譜解析

NMR研究的對(duì)象是具有磁矩的一類特殊原子核,具有磁矩的原子核有自旋性質(zhì),具有一定的自旋量子數(shù)(I),,N=0,1,2…(取整數(shù)),I=1/2的原子核在自旋過程中核外電子云呈均勻的球形分布,核磁共振譜線較窄,因此自旋量子數(shù)是1/2的核,如1H、13C和31P是NMR的主要測(cè)試對(duì)象。無外加磁場(chǎng)時(shí),核的自旋是無規(guī)則的。若將原子核置于外加磁場(chǎng)中,則核可以形成規(guī)則的自旋取向。外加磁場(chǎng)中,自旋量子數(shù)為I的核,共有2I+1個(gè)自旋取向,每個(gè)自旋取向用磁量子數(shù)m表示,m=I,I-1,I-2,0,…,-1。以1H為例,磁量子數(shù)有兩個(gè)值,m=1/2,m=-1/2,也就是說1H在外加磁場(chǎng)B0中,核有兩個(gè)自旋取向,m=1/2,自旋取向與外加磁場(chǎng)一致,能量較低;m=-1/2時(shí),自旋取向與外加磁場(chǎng)方向相反,能量較高。在外加磁場(chǎng)中核發(fā)生的能級(jí)分裂是核磁共振的基礎(chǔ)。當(dāng)用特定頻率的電磁波照射磁場(chǎng)中的1H核時(shí),核的自旋取向就會(huì)由低能態(tài)躍遷到高能態(tài)[13-14]。

在肉品科學(xué)主要應(yīng)用三種NMR波譜,根據(jù)不同的元素可以分為核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)、核磁共振碳譜(13C nuclear magnetic resonance,13C NMR)和核磁共振磷譜(31P nuclear magnetic resonance,31P NMR),這三種波譜分別可以檢測(cè)含H化合物,含C化合物和含P化合物的組成和結(jié)構(gòu)。下面以1H NMR為例簡單解析NMR波譜,1H NMR波譜主要提供下列信息:通過峰的數(shù)目得到標(biāo)志分子中磁不等價(jià)質(zhì)子的種類;通過峰的強(qiáng)度(面積)可以得到每類質(zhì)子的數(shù)目(相對(duì));通過峰的位移(δ)的得到每類質(zhì)子所處的化學(xué)環(huán)境;通過峰的裂分?jǐn)?shù)得到相鄰碳原子的質(zhì)子數(shù);通過耦合常數(shù)(J)確定化合物的構(gòu)型[13-14]。

2 基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)數(shù)據(jù)處理方法

基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)所得的數(shù)據(jù)具有高維,小樣本,高噪聲等復(fù)雜特征,因此采用常規(guī)統(tǒng)計(jì)方法不能發(fā)現(xiàn)樣品之間和各組之間的異同,通常采用以下兩類分析方法:非監(jiān)督分析方法,主成分分析法(principal component analysis,PCA)和聚類分析法(hierarchical cluster analysis,HCA);有監(jiān)督分析方法,偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)、正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal projection to latent structures discrimination analysis,OPLS-DA)。一般而言,數(shù)據(jù)處理順序都是先利用非監(jiān)督分析法直觀的說明不同樣品之間的差異;其次利用有監(jiān)督的分析方法擴(kuò)大組間差異,但是需要通過排列實(shí)驗(yàn)來證明模型的有效性[15]。除此之外,機(jī)器學(xué)習(xí)算法諸如隨機(jī)森林(random forests,RF)和支持向量機(jī)(support vector machine,SVM)也被應(yīng)用到代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)處理方法中[16]。

3 NMR代謝組學(xué)技術(shù)在肉品科學(xué)中的應(yīng)用

NMR代謝組學(xué)技術(shù)具有整體觀的思路,不再局限于分析某一個(gè)或者某幾個(gè)化合物,在數(shù)據(jù)處理時(shí)需要運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析,不僅從整體上區(qū)分不同樣品,還能識(shí)別區(qū)分差異的特殊標(biāo)志物。NMR代謝組學(xué)已經(jīng)被應(yīng)用于確定原料肉產(chǎn)地的問題、區(qū)分不同品種的原料肉、不同年齡肉畜的原料肉、不同飼料喂養(yǎng)對(duì)肉品質(zhì)的影響、不同成熟時(shí)間的原料肉、不同輻照強(qiáng)度處理過的原料肉、不同儲(chǔ)存時(shí)間和溫度對(duì)肉品質(zhì)的影響和解決肉制品摻假問題。

3.1 NMR代謝組學(xué)研究宰前因素對(duì)肉品質(zhì)的影響

影響肉品質(zhì)的宰前因素主要包括:遺傳因素,物種、品種、性別和年齡;營養(yǎng)因素,飼料的能量、組成和喂養(yǎng)方式;宰前應(yīng)激因素,宰前休息、宰前禁食和宰前淋浴;原料肉的解剖學(xué)位置[17-19]。NMR代謝組學(xué)已被部分學(xué)者采用研究宰前因素對(duì)肉品質(zhì)的影響。

原料肉產(chǎn)地不同導(dǎo)致肉制品和原料肉的NMR代謝組學(xué)數(shù)據(jù)不同,進(jìn)而通過此技術(shù)確定原料肉產(chǎn)地。Shintu[20]等利用MAS-NMR區(qū)分了來自于澳大利亞、巴西、加拿大、瑞士和美國的牛肉干。通過PCA分析數(shù)據(jù)確定了不同國家的牛肉干的差異性,并且確定了部分代謝物如肌肽、酪氨酸、肉毒堿和苯丙氨酸可以作為標(biāo)志物區(qū)分不同國家的牛肉干,經(jīng)有監(jiān)督的多元統(tǒng)計(jì)分析模型驗(yàn)證,此研究中80%的樣品可以被準(zhǔn)確地確定產(chǎn)地。Jung[21]等也利用NMR代謝組學(xué)區(qū)分了來源于四個(gè)不同國家的牛肉(澳大利亞、新西蘭、韓國、美國),盡管樣品數(shù)量有限,但是仍然顯示出NMR代謝組學(xué)在此方面的潛力。

肉畜的品種、肌肉的解剖學(xué)位置和雜交種的親本影響肉的品質(zhì)。Ritota[22]等利用NMR對(duì)契安尼娜牛、瑪萊瑪娜牛、荷斯坦牛、美洲野牛四種牛的背最長肌、半腱肌提取物進(jìn)行代謝組學(xué)分析。通過PCA和PLS-DA多元統(tǒng)計(jì)分析,可以辨別出每種牛的背最長肌和半腱肌的不同,并且確定了用于區(qū)分的代謝標(biāo)志物。對(duì)于契安尼娜牛,代謝標(biāo)志物包括甘氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、肌肽、肉毒堿、?；撬?、乳酸、核苷酸、葡萄糖和脂肪酸;對(duì)于美洲野牛,代謝標(biāo)志物包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸和脂肪酸;對(duì)于瑪萊瑪娜牛,代謝標(biāo)志物包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、賴氨酸、精氨酸、醋酸鹽、丙酮酸鹽、羥丁酸鹽生物、肉毒堿、?；撬?、核苷酸、肌肽和脂肪酸。NMR代謝組學(xué)技術(shù)不能區(qū)分荷斯坦牛的背最長肌和半腱肌。在更深入的研究中,將肌肉按照功能或者感官特性分類,NMR代謝組學(xué)可以提供區(qū)分不同功能或者不同感官特性的肌肉的可靠信息。Straadt[23]等利用NMR代謝組學(xué)技術(shù)研究了五種雜交豬。五種雜交豬種分別為DLY(由杜洛克豬、約克豬和長白豬雜交)、ID(伊比利亞黑豬和杜洛克豬雜交)、ILY(伊比利亞黑豬、杜洛克豬和長白豬雜交)、MD(曼格里察豬和杜洛克豬雜交)、MLY(曼格里察豬、長白豬和約克豬雜交)。經(jīng)代謝組學(xué)分析,DLY肉樣中肌肽和肌苷酸含量低于其余四種,但是肌苷的水平高于其余四種;不同雜交種的肉中氨基酸含量、種類不同。由于肉的理化成分以及性質(zhì)決定著肉的感官特性,進(jìn)而影響肉品質(zhì),因此在此研究中Straadt[23]等嘗試將NMR代謝組學(xué)提供的代謝物信息與感官特性相聯(lián)系來挖掘NMR代謝組學(xué)技術(shù)在此方向的潛力,但是NMR代謝組學(xué)提供的信息與肉的部分感官特性如滋味和風(fēng)味沒有明顯的相關(guān)性。這可能是由于不同雜交豬的肉品質(zhì)在風(fēng)味和滋味方面沒有明顯的不同。但是在其他方面,如肉的嫩度和肌肽與代謝物信息有一定的相關(guān)性。

動(dòng)物的年齡同樣也可以對(duì)肉品質(zhì)造成影響。Liu[24]等研究了鴨的年齡對(duì)于肉品質(zhì)的影響,鴨分別在孵化后27、50、170、500 d進(jìn)行屠宰,NMR代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、延胡索酸、鵝肌肽、甜菜堿、?；撬岷图≤盏暮颗c動(dòng)物的年齡相關(guān)。雖然隨著年齡的增長,鴨肉中的風(fēng)味化合物呈現(xiàn)上升趨勢(shì),但是鴨肉的持水力,嫩度卻呈現(xiàn)下降趨勢(shì),綜合考慮,作者得出了屠宰年齡50 d的鴨肉質(zhì)的可接受度最高,這一結(jié)論也與之前的研究者得出的結(jié)論類似[25]。

一些生物活性物質(zhì)例如芝麻素具有抗氧化的能力,當(dāng)添加至動(dòng)物的飼料中時(shí),可以調(diào)節(jié)動(dòng)物的脂質(zhì)代謝,從而影響肉品質(zhì)[26]。Wagner[27]等用NMR代謝組學(xué)技術(shù)研究了在大西洋三文魚飼料中添加芝麻素對(duì)肉品質(zhì)的影響,通過PCA和OPLS-DA分析表明隨著芝麻素添加量增多,對(duì)n-6脂肪酸與n-3脂肪酸比例影響越大,代謝物如葡萄糖、糖原、亮氨酸、纈氨酸、肌氨酸、肉毒堿、乳酸和核苷增加,這些代謝物與能量代謝相關(guān),表明芝麻素影響三文魚的能量代謝。

3.2 NMR代謝組學(xué)研究宰后因素對(duì)肉品質(zhì)的影響

影響肉品質(zhì)的宰后因素主要有肉的存儲(chǔ)溫度,僵直后的成熟時(shí)間,以及人工處理因素例如電刺激等等,此前已經(jīng)很多研究從宏觀的角度研究了宰后因素對(duì)肉品質(zhì)的影響[28-30],近年來,NMR代謝組學(xué)被應(yīng)用于此研究方向。

肉的成熟影響著肉的嫩度和風(fēng)味,這主要因?yàn)閯?dòng)物屠宰后,組織蛋白酶和肌漿鈣離子激活因子在熟化過程中降解了一些關(guān)鍵性蛋白質(zhì),破壞了原有肌肉結(jié)構(gòu),同時(shí)組織蛋白酶的水解產(chǎn)物改善了肉的風(fēng)味[31]。為了對(duì)這些生化反應(yīng)過程有更加詳細(xì)的認(rèn)識(shí),研究人員應(yīng)用了NMR代謝組學(xué)技術(shù)。Graham[32]等研究了成熟時(shí)間為3、7、14和21 d的牛肉的區(qū)別,經(jīng)NMR代謝組學(xué)分析,不同成熟時(shí)間的牛肉氨基酸含量的不同,且隨著成熟時(shí)間的增長,氨基酸含量增多,這是由于隨著肉的成熟,蛋白水解所致。

Shumilina[33]等通過NMR代謝組學(xué)技術(shù)監(jiān)測(cè)在0 ℃和4 ℃存貯的三文魚代謝組所發(fā)生的變化,結(jié)果顯示共有31種代謝物影響魚的新鮮度和滋味,包括氨基酸、二肽、維生素、糖類、生物胺、以及ATP的降解產(chǎn)物,確定了計(jì)算魚的新鮮度(K值)所必須的代謝物;發(fā)現(xiàn)生物胺與K值的關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)。Shumilina[11]等還通過NMR代謝組學(xué)探究了三文魚副產(chǎn)品在存儲(chǔ)期間的質(zhì)量變化,得到了相同的結(jié)論。

3.3 NMR代謝組學(xué)在肉制品加工和肉制品安全問題中的應(yīng)用

在肉制品加工工程中,不同的加工處理方式,對(duì)肉品質(zhì)產(chǎn)生不同的影響,為了從分子層面識(shí)別不同的加工處理方式對(duì)肉品質(zhì)的影響,近年來,NMR代謝組學(xué)技術(shù)開始被應(yīng)用。輻照技術(shù)是一種殺菌處理方式,Zanardi[10,34]等利用NMR代謝組學(xué)技術(shù)分析被輻照處理的牛肉,確定了含有脂肪的輻照食品標(biāo)志物2-十二烷基環(huán)己酮,但是在肉制品吸收輻射能量小于8kGy時(shí),1H NMR檢測(cè)不出2-十二烷基環(huán)己酮。高壓處理是一種常見的增強(qiáng)肉制品品質(zhì)的方式,Yang[35]等研究了高壓處理對(duì)于鹵肉產(chǎn)品質(zhì)量的影響,通過NMR得到26種代謝物的信息,主要包括氨基酸類、糖類、有機(jī)酸類、核苷類以及它們的衍生物,通過PCA分析得出不同壓力處理對(duì)代謝組的影響,最終得出150 MPa是最經(jīng)濟(jì)的改善產(chǎn)品質(zhì)量的方式。肉制品尤其是發(fā)酵類的風(fēng)干腸,成熟時(shí)間決定著最終產(chǎn)品的組分以及質(zhì)量。Grossi[36]等利用NMR代謝組學(xué)技術(shù)分析不同成熟時(shí)間的帕爾瑪火腿中的游離氨基酸組分的變化,并進(jìn)行了定量。Garcia-Garcia[12]等通過西班牙風(fēng)干腸在0、2、4、7、11 d NMR代謝組數(shù)據(jù),識(shí)別了發(fā)酵期和風(fēng)干-成熟期在代謝組成分方面的不同,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和ATP的水解。

動(dòng)物食品摻假問題一直是人們關(guān)注的食品安全問題,已經(jīng)有多種較為成熟的肉類摻假鑒別技術(shù),例如免疫分析法、色譜分析法和熒光定量PCR法[37]。NMR代謝組學(xué)技術(shù)快速無損的特點(diǎn)獲得研究人員的關(guān)注,并被成功的應(yīng)用于此類研究中[2]。Jakes[38]等利用NMR代謝技術(shù)以兩種肉的氯仿提取物為樣本區(qū)分了牛肉和馬肉;無論是屠宰后的生鮮肉還是經(jīng)過凍融的肉,均可以區(qū)分,這一結(jié)果表明冷凍處理不會(huì)對(duì)分析產(chǎn)生影響。區(qū)分兩種肉的標(biāo)志物為不飽和脂肪酸,馬肉中的不飽和脂肪酸明顯比牛肉中高,尤其是亞麻酸。此研究體現(xiàn)了NMR代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用在肉制品摻假問題中的潛力。雖然在此實(shí)驗(yàn)中,研究者利用的是60 MHz的低場(chǎng)譜儀,但是其研究思路與NMR代謝組學(xué)一致[38]。

4 結(jié)論與展望

研究已經(jīng)證明NMR代謝組學(xué)在肉品科學(xué)領(lǐng)域具有很大實(shí)用性以及應(yīng)用潛力,其可以最大限度的保證樣品不被損害,并可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)的、動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè),因而得到更詳細(xì)的信息。1H NMR、13C NMR和31P NMR可以提供對(duì)肉品質(zhì)的影響最大的代謝物的信息,例如乳酸、糖原、還有含磷的能量化合物,因而被成功的應(yīng)用于分析這幾種代謝物影響肉品質(zhì)的機(jī)理。動(dòng)物的宰前管理,屠宰方式影響動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而影響動(dòng)物的代謝,因此,NMR代謝組學(xué)技術(shù)可以在以后應(yīng)用于動(dòng)物福利問題當(dāng)中,這正逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

NMR代謝組學(xué)技術(shù)雖然在肉品科學(xué)研究中應(yīng)用較少,但是其具有整體分析的效果,而且在識(shí)別小分子生物標(biāo)志物方面具有很大的潛力,正逐漸成為肉品科學(xué)中的一門新的分析方法,目前雖然通過該技術(shù)識(shí)別了一些標(biāo)志物,但是這些標(biāo)志物只是應(yīng)用在區(qū)分產(chǎn)地、品種、加工方式和貯存方式等,雖然有學(xué)者嘗試建立起標(biāo)志物與肉的食用品質(zhì)的相關(guān)性,效果并不理想,因而需要更進(jìn)一步的探討代謝物影響肉品質(zhì)的機(jī)理。想要實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo),則需要突破目前NMR技術(shù)和代謝組學(xué)技術(shù)的限制,因?yàn)槟壳敖?jīng)NMR識(shí)別的代謝物仍然是有限的,很多小分子代謝物并不能被識(shí)別,因此繼續(xù)發(fā)展超高分辨率的NMR技術(shù)是必需的。有的學(xué)者提出了NMR技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用,用質(zhì)譜技術(shù)彌補(bǔ)NMR技術(shù)對(duì)于低豐度代謝物檢測(cè)能力不足的問題,同時(shí),也有必要建立功能完整的代謝物數(shù)據(jù)庫。