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    牛奶源金黃色葡萄球菌血清型、毒力基因及PFGE分型

    2019-01-28 08:06:46劉保光李小申劉營(yíng)營(yíng)賀丹丹匡秀華高延玲胡功政
    食品科學(xué) 2019年2期
    關(guān)鍵詞:鮮牛奶腸毒素血清型

    劉保光,蔡 田,李小申,劉營(yíng)營(yíng),賀丹丹,匡秀華,高延玲,胡功政,

    (1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院,河南 鄭州 450046;3.河南省獸藥監(jiān)察所,河南 鄭州 450008)

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種常見(jiàn)的人獸共患病原菌,是導(dǎo)致食物中毒重要的食源性病原菌,也是造成人和動(dòng)物感染的主要病原菌之一[1-2]。金黃色葡萄球菌在自然界分布較廣泛,如空氣、土壤、食品等均可存在。據(jù)國(guó)外有關(guān)報(bào)道[3-5],金黃色葡萄球菌在奶及乳制品等食品中大量存在并廣泛流行,生鮮牛奶是金黃色葡萄球菌感染的潛在載體。在中國(guó),金黃色葡萄球菌是引起牛、羊乳房炎的重要病原菌之一,且在牛乳及羊乳中廣泛存在[6]。此外,金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生大量的毒力因子,主要包括腸毒素、剝脫毒素、中毒休克毒素-1和殺白細(xì)胞毒素等,這些毒力因子在金黃色葡萄球菌感染中扮演著重要角色[7]。研究發(fā)現(xiàn),攜帶腸毒素的金黃色葡萄球菌引起的食物中毒發(fā)生、發(fā)展比較迅速,對(duì)人類的身體健康危害較大,金黃色葡萄球菌攜帶的腸毒素是導(dǎo)致食源性中毒的主要毒力因子[8]。

    目前,金黃色葡萄球菌常用的分型方法主要有多位點(diǎn)序列分型、金黃色葡萄球菌蛋白A、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)和葡萄球菌盒式染色體mec分型等[9]。其中,PFGE分型被公認(rèn)為是細(xì)菌分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”,主要原理是利用金黃色葡萄球菌基因組DNA進(jìn)行原位酶切,分析菌株間遺傳相關(guān)性[10]。開(kāi)展金黃色葡萄球菌PFGE分型,對(duì)了解菌株的流行病學(xué)分子特征、控制克隆株的傳播具有重要的意義。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)金黃色葡萄球菌分離鑒定、耐藥性及分子分型報(bào)道較為多見(jiàn)[11-13],對(duì)患有奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌耐藥性、毒素基因檢測(cè)方面也有報(bào)道[14],但是,從健康奶牛采集的生鮮牛奶金黃色葡萄球菌莢膜多糖血清型鑒定、耐藥性及PFGE分型報(bào)道鮮見(jiàn)[15]。

    鑒于此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)河南省不同地區(qū)健康動(dòng)物牛奶源金黃色葡萄球菌進(jìn)行莢膜多糖血清型鑒定、毒力基因檢測(cè)及PFGE分型研究,旨在闡述該菌攜帶毒力基因情況及克隆傳播的分子特征,為生鮮牛奶的安全評(píng)價(jià)提供理論依據(jù),為下一步研究耐藥機(jī)制提供參考,這對(duì)加強(qiáng)我國(guó)乳及乳品血清型、毒力基因檢測(cè)及分子分型研究具有重要的理論意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌株來(lái)源

    80 株金黃色葡萄球菌于2014—2015年間采集于河南省不同地區(qū)(編號(hào)A1~A4)健康動(dòng)物奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)生鮮牛奶樣品,沙門(mén)菌H9812由河南省獸藥監(jiān)察所惠贈(zèng)。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    TSA、BHI及LB培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基 法國(guó)科瑪嘉公司。

    1.1.3 試劑

    內(nèi)切酶XbaI、SmaI 大連寶生物公司;2×Taq Master Mix、DNA Marker 北京康為世紀(jì)有限公司;Agarose L.M.P、蛋白酶K 北京索萊寶有限公司;SeaKem?Gold Agarose金膠瓊脂糖 美國(guó)Lonza公司。

    1.1.4 引物

    實(shí)驗(yàn)研究所用基因引物,均由上海生物工程有限責(zé)任公司合成、測(cè)序。

    1.2 儀器與設(shè)備

    高速臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Thermo公司;CHEE MAPPER型PFGE 美國(guó)伯樂(lè)公司;Gene Genius凝膠成像系統(tǒng) 英國(guó)Syngene公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 杭州晶格科學(xué)儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 細(xì)菌的分離鑒定

    將采集的牛奶樣經(jīng)離心取混勻沉淀物分別接種于BHI瓊脂、TSA瓊脂及科瑪嘉顯色培養(yǎng)基[16],經(jīng)37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),挑單菌落接種于BHI肉湯,涂片染色鏡檢,并通過(guò)VITEK-2系統(tǒng)鑒定。對(duì)鑒定后的菌株進(jìn)行基因組DNA提?。舆m量溶菌酶),作為PCR模板。為確證所分離菌株,參考相關(guān)報(bào)道[17],利用特異性引物(F:5’-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3’;R:5’-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增nuc基因及電泳檢測(cè),測(cè)序后在NCBI用BLAST比對(duì)。金黃色葡萄球菌ATCC 29213為陽(yáng)性對(duì)照菌株。

    1.3.2 莢膜多糖血清型鑒定

    金黃色葡萄球菌的莢膜多糖是其致病和免疫的基礎(chǔ),據(jù)有關(guān)研究表明[18],大概80%金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生cap5型或cap8型莢膜多糖,本實(shí)驗(yàn)利用(cap5 F:5’-GAAAGTGAACGATTAGTAGAA-3’,cap5 R:5’-GTACGAAGCGTTTTGATAGTT-3’;cap8 F:5’-GTGGGATTTTTGTAGCTTTT-3’,cap8 R:5’-CGCCTCGCTATATGAACTAT-3’)引物對(duì)cap基因可變區(qū)PCR擴(kuò)增。

    1.3.3 毒力基因測(cè)定

    對(duì)24 種毒力基因(腸毒素、溶血素、殺白細(xì)胞毒素、凝集因子、中毒休克毒素和表皮剝脫毒素6 大類)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[19-23]。PCR體系為20 μL,其中2×Taq Master Mix Premix Taq酶10 μL,模板DNA 2 μL,上下游引物各1 μL,去離子水6 μL。PCR參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)30 次,72 ℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增后分別取8 μL產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳。若陽(yáng)性,進(jìn)行測(cè)序,在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)。

    1.3.4 PFGE分型

    1.3.4.1 細(xì)菌培養(yǎng)與小膠塊制備

    金黃色葡萄球菌PFGE的操作參照美國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供的方法[24],挑取LB板上的單菌落接種于4 mL LB肉湯中,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng);收集菌液,10 000 r/min離心2 min,沉淀用200 μL TE緩沖液混勻,調(diào)整細(xì)菌濁度為1.8~2.4;向200 μL菌懸液加入6 μL溶葡萄球菌素酶(1 mg/mL),37 ℃作用4 h;再加入等體積的60 ℃預(yù)熱已融化的2%低熔點(diǎn)小膠,輕輕混勻后迅速倒入模具,4 ℃冷卻30 min,備用。

    1.3.4.2 細(xì)菌裂解與酶切

    將制備好的小膠塊放于2 mL EC細(xì)胞裂解液中裂解5 h以上,用TE緩沖液洗滌3~5 次,每次30 min,該過(guò)程在搖床緩慢搖,取約2 mm寬的膠條,用TE緩沖液平衡后,加入SmaI內(nèi)切酶4 μL于37 ℃酶切6 h。沙門(mén)菌H9812用XbaI內(nèi)切酶37 ℃酶切3 h。

    1.3.4.3 加樣、電泳及圖像分析

    配制1% SeaKem Gold瓊脂糖凝膠,把酶切好的膠條小心放入梳孔中,在空隙中加入融化的瓊脂糖凝膠封口,最后用1% SeaKem Gold瓊脂糖完全浸沒(méi)膠條,凝固后將整塊膠放入CHEF Mapper電泳儀的緩沖液中電泳。電泳條件:6 V/cm,脈沖時(shí)間5~42 s,14 ℃,角度120°,時(shí)間19 h。結(jié)束后將膠塊放入溴化乙錠中染色30 min,蒸餾水清洗10 min,用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖片,并保存為T(mén)IFF格式。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    使用BioNumerics軟件的UPGMA和Dice參數(shù)對(duì)圖片進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,得出聚類圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細(xì)菌分離鑒定

    350 份生鮮牛奶樣品經(jīng)分離培養(yǎng)、顯色培養(yǎng)基篩選、nuc基因PCR檢測(cè),共得到80 株金黃色葡萄球菌,檢出率為22.86%(表1)。河南4 個(gè)地區(qū)中,來(lái)自A1地區(qū)的樣品分離率最高,為34.9%(30/86);來(lái)自A4地區(qū)的樣品分離率最低,為12.5%(11/88)。

    表1 生鮮牛奶樣品中金黃色葡萄球菌的流行Table1 Prevalence of S. aureus isolates from fresh milk

    2.2 莢膜多糖血清型鑒定

    莢膜多糖血清型鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn),80 株金黃色葡萄球菌有70株可以通過(guò)莢膜多糖分型。48 株屬于cap5血清型(60%,48/80),22 株屬于cap8血清型(27.5%,22/80),本實(shí)驗(yàn)可見(jiàn),cap5血清型是流行血清型。

    2.3 毒力基因測(cè)定結(jié)果

    如表2所示,本實(shí)驗(yàn)中24 種毒力基因,有21 種被檢測(cè)到,但表皮剝脫毒素基因(eta、etb和etd)未檢測(cè)到。從80 株金黃色葡萄球菌中共檢測(cè)到62 株(77.5%)攜帶有毒力基因,檢測(cè)率較高。本實(shí)驗(yàn)檢出率較高的毒力基因有set、hlb、hld、lukED、cna、ebp、clfA和clfB,檢出率分別為40.00%(32/80)、51.25%(41/80)、57.50%(46/80)、60.00%(48/80)、47.50%(38/80)、58.75%(47/80)、57.50%(46/80)和58.75%(47/80)。中毒休克毒素(tsst)和殺白細(xì)胞毒素(pvl)檢出率較低,分別為1.25%(1/80)和2.50%(2/80)。

    80 株金黃色葡萄球菌中,攜帶的毒力基因譜型較為多樣化,既有含單個(gè)基因的,又有含多個(gè)基因的。但是,有47株(58.75%)菌攜帶不少于6種毒力基因,最常見(jiàn)的毒力基因譜型為set-hla-hlb-hld-lukED-cna-ebp-clfA-clfB(表2)。

    表2 金黃色葡萄球菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果(n=80)Table2 PCR detection of virulence genes from S. aureus isolates (n= 80)

    2.4 PFGE分型

    PFGE結(jié)果顯示,成功獲得72 株菌清晰的PFGE圖譜(72 株能被SmaI酶切開(kāi))。使用BioNumerics分析軟件進(jìn)行聚類,如圖1所示,以90%的相似性可將其分為12 個(gè)簇(A~L)和46 種PFGE型。其中A簇分為3 種PFGE型(3 株,PFGE1~PFGE3);B簇分為3 種PFGE型(5 株,PFGE5~PFGE7);C簇分為2 種PFGE型(2 株,PFGE9、PFGE10);D簇分為3 種PFGE型(11 株,PFGE11~PFGE13);E簇僅含有1 種PFGE型(2 株,PFGE14);F簇僅含有1 種PFGE型(2 株,PFGE17);G簇分為3 種PFGE型(7 株,PFGE18~PFGE20);H簇僅含有1 種PFGE型(3 株,PFGE22);I簇分為5 種PFGE型(7 株,PFGE25~PFGE29);J簇分為5 種PFGE型(9 株,PFGE30~PFGE34);K簇分為4 種PFGE型(6 株,PFGE35~PFGE38);L簇分為3 種PFGE型(3 株,PFGE42~PFGE44)。

    PFGE聚類表明,同一地區(qū)牛奶源金黃色葡萄球菌主要以克隆方式進(jìn)行傳播,但相同地區(qū)菌株呈現(xiàn)的PFGE型別具有多樣性的差異。盡管不同地區(qū)分離得到的菌株中有個(gè)別為相同的克隆型(如B簇、E簇),但是不同地區(qū)牛奶中流行的金黃色葡萄球菌的克隆型具有較大的差異。此外,D簇、G簇和J簇的菌株均檢出一定基因類型的毒力基因,表明河南地區(qū)生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌毒力基因廣泛存在于多種PFGE型別中。

    圖1 金黃色葡萄球菌PFGE圖譜聚類分析(n=72)Fig.1 Cluster analysis of PFGE types from S. aureus isolates (n = 72)

    3 討 論

    金黃色葡萄球菌是重要的人獸共患病原菌,要求在各類食品不被檢出。但本研究結(jié)果顯示,生鮮牛奶中存在一定程度的金黃色葡萄球菌污染,檢出率為22.86%,高于劉冬香等[25]報(bào)道的檢出率為10.54%,但低于張倩等[26]報(bào)道的檢出率47.24%。進(jìn)一步推測(cè)可能是與采集的樣品地點(diǎn)、樣品的數(shù)量及采集的年代等有關(guān)。此外,本實(shí)驗(yàn)利用PCR對(duì)金黃色葡萄球菌的nuc基因進(jìn)行擴(kuò)增,其檢測(cè)結(jié)果與通過(guò)微生物培養(yǎng)鑒定的結(jié)果100%符合。近年來(lái),各級(jí)政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)食品安全愈發(fā)重視,要求從源頭杜絕金黃色葡萄球菌對(duì)食品的污染,以降低金黃色葡萄球菌在各類食品中的檢出率。

    據(jù)劉秀麗等[27]報(bào)道,金黃色葡萄球菌莢膜多糖被分為11 個(gè)血清型,其中cap5型和cap8型為流行血清型,約占臨床菌株的70%~80%。Goerke等[18]研究發(fā)現(xiàn),cap8為流行血清型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,48 株屬于cap5血清型(60%,48/80),22 株屬于cap8血清型(27.5%,22/80),cap5為流行血清型。

    共檢測(cè)到62 株(77.5%)攜帶有毒力基因,且攜帶的毒力基因譜型多樣。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定牛奶源中金黃色葡萄球菌的腸毒素基因種類(sea~set)表明,腸毒素基因檢出率為90.00%(72/80),檢出率最高的為set(40.00%),其次為seb(17.50%)。據(jù)趙俊利等[14]報(bào)道金黃色葡萄球菌腸毒素基因(sea~seo)檢測(cè)率為96.2%,攜帶率最高的為sej(62.26%),其次為sen(49.06%)。據(jù)張靜等[28]測(cè)定原料乳中金黃色葡萄球菌腸毒素基因(sea~sej)研究表明,腸毒素基因檢出率為70.45%,檢出率最高的為sea(56.82%)。推測(cè)這可能與菌株來(lái)源、地域性質(zhì)等有一定關(guān)系,也進(jìn)一步說(shuō)明不同地區(qū)生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌腸毒素基因的流行不同。據(jù)章樂(lè)怡等[29]報(bào)道傳統(tǒng)腸毒素基因(sea~see)占金黃色葡萄球菌引起食物中毒的95%。本研究也檢測(cè)到傳統(tǒng)腸毒素基因(sea~see),進(jìn)一步說(shuō)明河南省生鮮牛奶中存在一定的安全隱患,應(yīng)予以重視。

    但是,本研究中,殺白細(xì)胞毒素(pvl)的檢出率較低,僅為2.50%(2/80),與謝秀蘭等[30]報(bào)道的檢出率34.4%存在較大差異,這說(shuō)明不同地區(qū)pvl的檢出率不盡相同,進(jìn)一步暗示了牛奶等食品中pvl基因的流行可能存在一定的地域差異。攜帶毒力基因hlb、hld、lukED、ebp、clfA和clfB的菌株均達(dá)50%以上,有47 株(58.75%)菌攜帶多種毒力基因,毒力基因譜型set-hla-hlb-hld-lukED-cna-ebp-clfA-clfB最為常見(jiàn)。這與楊峰等[31]報(bào)道含lukED、hlb和hld基因的菌株均達(dá)70%以上相吻合。雖毒力基因并不能作為菌株致病的標(biāo)準(zhǔn),而其潛在的風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)當(dāng)予以關(guān)注。但攜帶高頻的hlb、hld、lukED、ebp、clfA和clfB毒力基因,暗示其在致病性方面具有重要作用。

    本研究對(duì)牛奶源金黃色葡萄球菌PFGE型別進(jìn)行分析,建立河南地區(qū)牛奶源金黃色葡萄球菌PFGE分型數(shù)據(jù)庫(kù),包含12 個(gè)簇和46 種PFGE型。PFGE聚類表明,同一地區(qū)的菌株主要以克隆傳播進(jìn)行擴(kuò)散,且相同地區(qū)的菌株呈現(xiàn)的PFGE型別具有多樣性。而不同地區(qū)菌株又可劃分在同一PFGE型別中,如B簇和E簇,表明該型菌株在河南地區(qū)不同奶牛場(chǎng)具有一定流行性,這與王桂琴等[32]的報(bào)道認(rèn)為一些菌株呈現(xiàn)相同的PFGE型別能在不同奶牛場(chǎng)流行觀點(diǎn)相一致,推測(cè)可能存在一定的傳播。另外,D簇、G簇和J簇均檢出一定基因類型的毒力基因,表明河南地區(qū)生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌毒力基因廣泛存在于多種PFGE型別中,揭示這幾種PFGE型別的流行可能與毒力基因的存在有一定的相關(guān)性。此外,本研究發(fā)現(xiàn)8株不能被SmaI酶切的菌株,據(jù)有關(guān)研究報(bào)道[33],這種類型菌株可在動(dòng)物與人之間傳播,具有較大的危害性。

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