雙孢蘑菇轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及褐變相關(guān)基因的挖掘

彭 博，李炳娟,，關(guān)文強(qiáng),，林 瓊

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又名白蘑菇、紐扣蘑菇等，是世界市場(chǎng)上最常見(jiàn)的食用栽培蘑菇，其風(fēng)味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。但是雙孢蘑菇組織細(xì)嫩且菌蓋無(wú)明顯的保護(hù)結(jié)構(gòu)，在采后貯藏和流通過(guò)程中極易發(fā)生褐變，從而影響蘑菇的質(zhì)量，使商品貶值，導(dǎo)致一定的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）被認(rèn)為是引起雙孢蘑菇褐變的主要酶類(lèi)，包括酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶和漆酶（laccase，LAC）。酚類(lèi)底物在PPO的作用下氧化形成易聚合生成黑色素的醌類(lèi)物質(zhì)，加速雙孢菇褐變。因此，探究雙孢蘑菇在貯藏過(guò)程中PPO的調(diào)控機(jī)理對(duì)后期改良雙孢蘑菇品質(zhì)具有關(guān)鍵指導(dǎo)意義。

近年關(guān)于PPO的研究大多基于酶特性和基因角度進(jìn)行研究。目前，已有鴨梨[4]、草莓[5]、陸地棉[6]、馬鈴薯[7]等多個(gè)植物PPO基因被克隆。在雙孢蘑菇PPO基因研究中，Wichers等[8]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得cDNA片段，篩選出2 個(gè)全長(zhǎng)為1.8 kb和1.9 kb的基因AbPPO1和AbPPO2；Li Nanyi等[2]通過(guò)同源克隆和RACE獲得AbPPO3和AbPPO4，分別編碼66、68 kb的蛋白；Weijn等[9]獲得AbPPO5和AbPPO6的編碼序列；冉欣欣[10]研究表明，在不同發(fā)育階段，不同貯藏時(shí)期的雙孢蘑菇子實(shí)體PPO基因家族成員的表達(dá)存在差異性。但由于雙孢蘑菇PPO調(diào)控褐變機(jī)理相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)及基因組學(xué)信息匱乏，研究進(jìn)程緩慢，因此，有必要探索雙孢蘑菇基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因發(fā)現(xiàn)和功能研究。

隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)因其具有通量大、低成本、高分辨率、高靈敏度、檢測(cè)范圍廣、不需克隆且操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)成為轉(zhuǎn)錄組研究的主要手段[11-16]。近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在食用菌中得到廣泛應(yīng)用。Tang Lihua等[17]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)3 種不同條件下生長(zhǎng)的香菇菌絲體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出香菇與光誘導(dǎo)褐色膜形成相關(guān)的基因。易琳琳[18]通過(guò)新一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)2 種不同處理方式的香菇子實(shí)體測(cè)序，篩選出15 個(gè)與細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶相關(guān)基因。吳小梅等[19]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)3 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的蘑菇進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出2 個(gè)發(fā)育關(guān)鍵基因和8 個(gè)與發(fā)育相關(guān)的基因。

本實(shí)驗(yàn)采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)采后4 ℃貯藏第1、7和14天的雙孢蘑菇菌蓋進(jìn)行測(cè)序，擬從轉(zhuǎn)錄組水平分析雙孢蘑菇在不同貯藏時(shí)間基因的表達(dá)差異，進(jìn)而對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO（Gene Ontology）功能和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，同時(shí)篩選與褐變相關(guān)的基因，為今后雙孢蘑菇褐變的研究和品質(zhì)改良等提供一定的理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇采自天津市閩中食用菌種植基地，采取新鮮健康、無(wú)開(kāi)傘、色澤潔白、大小均一（直徑3～4 cm）的優(yōu)質(zhì)蘑菇置于泡沫盒中，立即運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，置于4 ℃貯藏。

Trizol?Reagent 美國(guó)Life Technologies公司；三氯甲烷（氯仿） 青島精科儀器試劑有限公司；鄰苯二酚天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；NanoPhotometer?分光光度計(jì) 美國(guó)Implen公司；2100生物分析儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將雙孢蘑菇分裝入聚乙烯包裝袋中，置于（4±0.5）℃冰溫庫(kù)中預(yù)冷24 h后封口貯藏。以預(yù)冷后24 h的第1天設(shè)置為1 d，分別在1、7、14 d隨機(jī)取3 袋，取雙孢蘑菇的菌蓋切碎，置于液氮速凍，分別記為Pile_C1、Pile_C7、Pile_C14。

1.3.2 褐變度的測(cè)定

參照Lei Jing等[20]的方法：準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g液氮速凍的雙孢蘑菇菌蓋組織，加入5 mL預(yù)冷的95%乙醇溶液，冰浴研磨成漿，于4 ℃、8 000 r/min離心10 min。取上清液，測(cè)定其410 nm波長(zhǎng)處吸光度，即褐變度。

1.3.3 總RNA的提取與測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建

圖1 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建Fig.1 Construction of cDNA library

采用Trizol法[21]提取雙孢菇菌蓋RNA，利用NanoPhotometer?分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度、OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm值。利用生物分析儀精確檢測(cè)RNA完整性（用RIN表示）和25S/18S值。RNA樣品標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度不低于250 ng/μL，OD260nm/OD280nm值應(yīng)介于1.8～2.2之間，OD260nm/OD230nm值不小于1.8，RIN不低于6.5，25S/18S值不低于1.0。樣品檢測(cè)合格后，由北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行cDNA文庫(kù)的構(gòu)建（圖1）及高通量測(cè)序。

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

1.3.4.1 序列數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估及與參考基因組比對(duì)

高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列，為保證信息分析質(zhì)量，必須對(duì)原始序列進(jìn)行過(guò)濾，得到clean reads，后續(xù)分析都基于clean reads。

選取HISAT軟件將過(guò)濾后的測(cè)序序列進(jìn)行基因組定位分析。HISAT能夠有效地比對(duì)RNA seq測(cè)序數(shù)據(jù)中的spliced reads，是目前比對(duì)率最高且最準(zhǔn)確的比對(duì)軟件。

1.3.4.2 差異表達(dá)基因篩選及聚類(lèi)分析

使用FPKM法估算基因表達(dá)水平，對(duì)read count進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后根據(jù)模型進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)概率（P值）的計(jì)算，最后進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，得到錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR)。按照∣log2（兩組樣品表達(dá)量比值）∣＞1且q＜0.005的原則篩選DEGs。

聚類(lèi)分析用于判斷DEGs在不同貯藏時(shí)間下的表達(dá)模式。以不同貯藏時(shí)間的差異基因FPKM值為表達(dá)水平，做層次聚類(lèi)分析，不同顏色的區(qū)域代表不同的聚類(lèi)分組信息，同組內(nèi)的基因表達(dá)模式相近，可能具有相似的功能或參與相同的生物學(xué)過(guò)程。

1.3.4.3 GO富集分析和Pathway富集分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮Y選差異基因后，富集分析研究差異基因在GO中的分布狀況以期闡明實(shí)驗(yàn)中樣本差異在基因功能上的體現(xiàn)。根據(jù)挑選出的差異基因計(jì)算這些差異基因同GO分類(lèi)中某幾個(gè)特定分支的超幾何分布關(guān)系，通過(guò)假設(shè)驗(yàn)證得到一個(gè)特定p值，進(jìn)而判斷差異基因在該GO中出現(xiàn)富集的情況。在分析中GO富集分析采用的軟件方法為GO seq[22]。

在生物體內(nèi)，通過(guò)Pathway顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。作為Pathway相關(guān)的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)[23]，KEGG是進(jìn)行生物體內(nèi)代謝分析、代謝網(wǎng)絡(luò)研究的強(qiáng)有力工具。Pathway顯著性富集分析以KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出在差異表達(dá)基因中顯著性富集的Pathway。FDR≤0.05時(shí)，表示差異基因在該P(yáng)athway中顯著富集，使用KOBAS（2.0）進(jìn)行Pathway富集分析。

1.3.5 PPO活性的測(cè)定

參考Mdelosa等[24]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g液氮速凍的雙孢蘑菇菌蓋組織研磨成粉，加入8 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.5）研磨成漿后，于4 ℃、8 000 r/min離心15 min，取上清液（即粗酶液）于4 ℃冰箱中備用。室溫下，取2.9 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.5）、1.0 mL 0.1%鄰苯二酚和1.0 mL PPO粗酶液于10 mL試管中混勻后開(kāi)始計(jì)時(shí)，測(cè)量420 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化。以磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.5）和0.1%鄰苯二酚為底物，在25 ℃、pH 6.5和波長(zhǎng)420 nm處吸光度每分鐘變化0.01為1 個(gè)酶活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007、Origin 8、SPSS 16.0和PowerPoint 2007等軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙孢蘑菇貯藏時(shí)間褐變度的變化

圖2 采后雙孢蘑菇4 ℃貯藏時(shí)間褐變度的變化Fig.2 Changes in browning degree during storage of A. bisporus at 4 ℃

由圖2可知，在4 ℃貯藏時(shí)間雙孢蘑菇褐變度隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。果蔬采后運(yùn)輸和加工過(guò)程中易產(chǎn)生黑色素而引起褐變，會(huì)影響果蔬的銷(xiāo)售及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。為進(jìn)一步探究雙孢蘑菇褐變的機(jī)理，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 RNA質(zhì)量檢測(cè)

表1 雙孢蘑菇3 組樣品RNA質(zhì)量檢測(cè)Table1 Evaluation of total RNA extracted from three samples of A. bisporus

由表1可知，所提取的3 組RNA質(zhì)量較好，可以進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建以及后續(xù)測(cè)序分析。

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

表2 3 組樣品數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量情況Table2 Quality assessment of sequencing output data of three samples

為探究雙孢蘑菇采后貯藏過(guò)程中的變化機(jī)制，對(duì)雙孢蘑菇菌蓋3 個(gè)貯藏時(shí)間的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，共獲得176 329 392 個(gè)原始片段，對(duì)原始片段過(guò)濾后，獲得168 607 212 個(gè)剩余片段。由表2可知，Pile_C1、Pile_C7、Pile_C14三組的Q20值分別為96.49%、96.43%和96.99%，Q30值分別為91.26%、91.12%和92.18%，GC相對(duì)含量分別為49.61%、49.67%和49.57%。綜上，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的數(shù)量和質(zhì)量較高，可用于后續(xù)分析。

由表3可知，Pile_C1、Pile_C7、Pile_C14三組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的clean reads中，能定位到基因組上的reads片段有135 603 695 個(gè)，占比78.89%～82.5%，在參考序列上有多個(gè)比對(duì)位置的reads片段有1 627 747 個(gè)，占比0.93%～1.04%，在參考序列上有唯一比對(duì)位置的reads片段有133 975 948 個(gè)，占比77.84%～81.58%，比對(duì)到基因組上正鏈的reads片段有66 778 656 個(gè)，占比38.69%～40.67%，比對(duì)到基因組上負(fù)鏈的reads片段有67 197 292 個(gè)，占比39.16%～40.91%。能定位到基因組上的reads片段中，分段比對(duì)到兩個(gè)外顯子上的reads片段有61 654 288 個(gè)，占比35.45%～37.83%，整段比對(duì)到外顯子的reads片段有72 321 660 個(gè)，占比41.63%～43.74%。

表3 Reads與參考基因組比對(duì)情況Table3 Results of mapping relative to the reference genome

樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性用皮爾遜相關(guān)系數(shù)的平方（R2）表示。相關(guān)系數(shù)R2越接近1，表明樣品之間表達(dá)模式的相似度越高。由圖3可知，Pile_C1與Pile_C7間的相關(guān)系數(shù)R2為0.927，Pile_C1與Pile_C14間的相關(guān)系數(shù)R2為0.845，Pile_C7與Pile_C14間的相關(guān)系數(shù)R2為0.917，說(shuō)明結(jié)果可靠且樣本選擇合理。

圖3 Pile_C1、Pile_C7、Pile_C14三組樣品間相關(guān)系數(shù)Fig.3 Correlation coefficients between Pile_C, Pile_C7 and Pile_C14

2.4 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

圖4 差異表達(dá)基因維恩圖Fig.4 Venn diagram of differentially expressed genes (DEGs)

圖5 不同貯藏時(shí)間雙孢蘑菇菌蓋差異表達(dá)基因火山圖Fig.5 Volcano diagram of DEGs in A. bisporus pilei at different storage periods

由圖4、5可知，Pile_C7與Pile_C1比較，共篩選出727 個(gè)差異表達(dá)的基因，其中Pile_C7組相對(duì)于Pile_C1組上調(diào)基因354 個(gè)，占總差異表達(dá)48.7%，下調(diào)基因373 個(gè)，占總差異表達(dá)51.3%。Pile_C14與Pile_C1比較，共篩選出1 524 個(gè)差異表達(dá)的基因，其中Pile_C14組相對(duì)于Pile_C1組上調(diào)基因768 個(gè)，占總差異表達(dá)50.4%，下調(diào)756 個(gè)，占總差異表達(dá)49.6%。

為判斷差異基因在不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)模式，篩選了95 個(gè)差異基因采用熱圖形式對(duì)其進(jìn)行聚類(lèi)分析。圖6顯示了95 個(gè)基因的聚類(lèi)相關(guān)性，其中，38 個(gè)基因在貯藏過(guò)程中表達(dá)量呈下降趨勢(shì)；3 個(gè)基因在貯藏1 d有較低表達(dá)，7 d表達(dá)量較高，14 d顯著降低；11 個(gè)基因在貯藏1 d表達(dá)量較低，7 d和14 d表達(dá)量較高；6 個(gè)基因在貯藏7 d表達(dá)量較低，14 d表達(dá)量顯著升高；14 個(gè)基因在貯藏過(guò)程中表達(dá)量逐漸升高；14 個(gè)基因在貯藏1 d和7 d表達(dá)量較低，14 d表達(dá)量較高。

圖6 雙孢蘑菇菌蓋差異表達(dá)基因聚類(lèi)圖Fig.6 Clustering analysis of DEGs in A. bisporus pilei

2.5 差異表達(dá)基因GO富集分析

圖8 雙孢蘑菇Pile_C14 vs Pile_C1差異基因GO富集結(jié)果Fig.8 GO function of DEGs of A. bisporus in Pile_C14 vs Pile_C1

對(duì)不同貯藏時(shí)間的雙孢蘑菇菌蓋DEGs進(jìn)行GO富集分析，鑒于差異表達(dá)基因數(shù)目較多，本研究?jī)H對(duì)GO三大功能類(lèi)別靠前的條目進(jìn)行富集分析。由圖7可知，對(duì)Pile_C7和Pile_C1組進(jìn)行顯著富集，細(xì)胞組分、生物過(guò)程和分子功能三大功能類(lèi)別分別包含了4、16 個(gè)和23 個(gè)功能分類(lèi)。細(xì)胞組分類(lèi)別中，富集到胞質(zhì)的差異基因較多；生物過(guò)程類(lèi)別中，富集到氧化還原過(guò)程、磷代謝過(guò)程和糖代謝的差異基因較多；分子功能中，富集到水解酶活性、核苷酸結(jié)合、核苷磷酸結(jié)合和陽(yáng)離子結(jié)合的差異基因較多。對(duì)Pile_C14和Pile_C1組進(jìn)行顯著富集，由圖8可知，細(xì)胞組分、生物過(guò)程和分子功能三大功能類(lèi)別分別包含了8、21 個(gè)和19 個(gè)功能分類(lèi)。細(xì)胞組分類(lèi)別中，富集到膜和細(xì)胞器的差異基因較多；生物過(guò)程類(lèi)別中，富集到氧化還原過(guò)程和有機(jī)氮化合物代謝；分子功能中，富集到氧化還原活性和陽(yáng)離子結(jié)合的差異基因較多。

2.6 差異表達(dá)基因Pathway顯著性富集分析

雙孢蘑菇Pile_C7組與Pile_C1組差異表達(dá)基因中共有459 個(gè)基因被注釋到83 條KEGG代謝通路中；Pile_C14組與Pile_C1組差異表達(dá)基因中共有876 個(gè)基因被注釋到97 條KEGG代謝通路中，其中包含10 條顯著性富集代謝通路，分別是類(lèi)固醇生物合成、氨酰-tRNA生物合成、抗生素生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、果糖和甘露糖代謝、氧化磷酸化、半乳糖代謝、甘油脂代謝、磷酸戊糖途徑和次生代謝產(chǎn)物的生物合成，這些途徑大都與雙孢蘑菇生理代謝相關(guān)。

2.7 褐變相關(guān)差異表達(dá)基因篩選

圖9 褐變相關(guān)基因篩選結(jié)果Fig.9 Screening of browning-related genes

由圖9可知，從3 組雙孢蘑菇菌蓋在不同貯藏時(shí)間的差異表達(dá)基因中篩選出與多酚氧化酶相關(guān)的基因有5 個(gè)，這些基因包括多酚氧化酶基因和漆酶基因。其中，PPO3（18 085 507）在貯藏第7天時(shí)表達(dá)量最低，在貯藏第14天時(shí)基因表達(dá)量上調(diào)，這與Li[2]和Lei Jing[20]等的研究結(jié)果一致。PPO1（18 082 695）在貯藏時(shí)間表達(dá)量下調(diào)。LAC4（18 085 498）、PPO5（18 078 406）和LAC1（18 080 537）3 個(gè)基因表達(dá)量在貯藏期間呈上調(diào)趨勢(shì)，且在第7天和第14天期間基因表達(dá)量顯著上調(diào)。

基因表達(dá)分析結(jié)果表明，在雙孢蘑菇不同貯藏時(shí)間PPO家族成員的表達(dá)具有差異性，漆酶基因LAC1和LAC4在貯藏時(shí)間表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。吳小梅[19]的研究結(jié)果表明漆酶基因在紐扣期至成熟早期表達(dá)量穩(wěn)步增加，在成熟期表達(dá)量達(dá)到最高，與本研究結(jié)果一致。吳光美等[25]的研究表明fv-lac4基因隨著原基出現(xiàn)表達(dá)量開(kāi)始增加，且菌蓋中表達(dá)量低于菌柄，這一研究結(jié)果也表明該基因可能與雙孢蘑菇褐變無(wú)關(guān)。卓睿等[26]研究表明糙皮側(cè)耳漆酶基因lacc4在原基分化期高表達(dá)，推測(cè)其可能與原基分化相關(guān)。

2.8 雙孢蘑菇貯藏時(shí)間PPO活性變化

圖10 采后雙孢蘑菇4 ℃貯藏時(shí)間PPO活性的變化Fig.10 Changes in PPO activity during storage of A. bisporus at 4 ℃

從圖10可以看出，雙孢蘑菇PPO活性隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)。Lei Jing等[20]研究結(jié)果表明AbPPO1基因表達(dá)的影響模式與其對(duì)褐變度和PPO活性的影響模式不一致，而AbPPO3基因與褐變度和PPO活性的影響模式一致，認(rèn)為AbPPO1基因可能不參與雙孢蘑菇褐變的形成，AbPPO3參與雙孢蘑菇的褐變。PPO是引起雙孢蘑菇褐變的主要酶，其主要通過(guò)將酚類(lèi)物質(zhì)氧化為醌，進(jìn)一步產(chǎn)生黑色素，從而導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的發(fā)生。將PPO活性與PPO3基因表達(dá)做Pearson相關(guān)性分析得到系數(shù)為－0.777，表明兩者具有一定的相關(guān)性，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果具有一致性。Van Leeuwen等[27]研究表明，雙孢蘑菇菌蓋皮層褐變程度與PPO活性呈正相關(guān)關(guān)系，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

4 ℃貯藏時(shí)間雙孢蘑菇褐變度隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，并對(duì)此條件下的雙孢蘑菇菌蓋轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行Illumina HiSeqTM高通量測(cè)序，共獲得176 329 392 個(gè)raw reads，168 607 212 個(gè)高質(zhì)量的clean reads。按照︱log2（兩組樣品表達(dá)量比值）︱＞1且q＜0.005的原則，Pile_C7與Pile_C1組共篩選出727 個(gè)差異表達(dá)基因，Pile_C14與Pile_C1組共篩選出1 524 個(gè)差異表達(dá)基因。GO功能富集結(jié)果顯示，Pile_C7與Pile_C1組中，胞質(zhì)、氧化還原過(guò)程和水解酶活性分別是細(xì)胞組分、生物過(guò)程和分子功能富集最多的條目；Pile_C14與Pile_C1組中，膜、氧化還原過(guò)程和氧化還原活性分別是細(xì)胞組分、生物過(guò)程和分子功能富集最多的條目。Pathway富集分析發(fā)現(xiàn)，Pile_C7與Pile_C1組中459 個(gè)差異表達(dá)基因被成功注釋到83 條KEGG代謝通路中；Pile_C14與Pile_C1組中876 個(gè)差異表達(dá)基因被成功注釋到97 條KEGG代謝通路中，其中10 條為顯著富集通路（P＜0.05）。從獲得的差異表達(dá)基因中篩選得到5 個(gè)多酚氧化酶相關(guān)基因，PPO3、PPO1、PPO5、LAC1和LAC4。雙孢蘑菇多酚氧化酶活性隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果有一致性。研究結(jié)果為進(jìn)一步分析差異基因與褐變的調(diào)控關(guān)系，及為雙孢蘑菇品種改良提供科學(xué)依據(jù)。