1 株水蜜桃采后病害拮抗細(xì)菌的鑒定及抑菌作用

李培中，許 麗，何惠霞，尹京苑，高海燕,

（1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)，上海 201418；3.上海佳邁農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 201300；4.上海大學(xué)計(jì)算機(jī)工程與科學(xué)學(xué)院，上海 200444）

水蜜桃作為一種常見的水果，其味甜汁多，營養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，目前主產(chǎn)于華東地區(qū)。由于水蜜桃屬于典型的呼吸躍變型水果，貯藏期間會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的失水、硬度下降、果肉褐變等問題，同時(shí)，其采收多集中在高溫多雨的7、8月份，極易受真菌感染，故耐貯性差，因此水蜜桃的采后保鮮一直是影響果農(nóng)收入的主要問題[1]。先前已有報(bào)道若干病原真菌可導(dǎo)致采后桃果實(shí)發(fā)病，例如：交鏈孢霉（Alternaria alternata）[2]、桃褐腐菌（Monilinia fructicola）[3]、復(fù)端孢霉（Cephalothecium sp.）與絲核菌（Rhizoctonia sp.）[4]等。

對于水蜜桃采后病害的防治，目前仍以化學(xué)殺菌劑為主，但防效不甚理想，而且長期使用化學(xué)殺菌劑不但會(huì)導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)在食品安全及生態(tài)環(huán)境方面也會(huì)導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的負(fù)面后果[5]。為克服這些問題，急需一種對環(huán)境友好且性價(jià)比高的方法，而生物防治則可以滿足這些需求[6]。生物防治中主要應(yīng)用的是微生物防治，是指將拮抗微生物或其代謝產(chǎn)物作用于果體，與致病菌產(chǎn)生拮抗作用，從而抑制致病菌的生長，防止由致病菌引起的腐爛，從而達(dá)到保鮮目的[7]。在水蜜桃采后保鮮的拮抗微生物中，已報(bào)道的有羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）[8]、熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fl uorescens）[9]、芽孢桿菌（Bacillus spp.）[10-13]等。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究從豆腐乳中分離得到了1 株對水蜜桃采后病害具有較好防治效果的生防菌株，將其編號為CF-2。本研究旨在通過形態(tài)學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)等方法對生防菌株CF-2進(jìn)行鑒定，并探究其生物學(xué)特性及對水蜜桃采后病原真菌的抑制作用，以期為進(jìn)一步研究利用生物防治方法提供參考，為解決水蜜桃采后腐爛變質(zhì)的病害控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生防細(xì)菌：生防菌CF-2菌株，由上海大學(xué)生命學(xué)院食品質(zhì)量與安全控制實(shí)驗(yàn)室篩選分離并保存。

病原真菌：交鏈孢霉、桃褐腐菌、復(fù)端孢霉、絲核菌，由上海大學(xué)生命學(xué)院食品質(zhì)量與安全控制實(shí)驗(yàn)室從水蜜桃果實(shí)上分離并保存。

水果：供試品種“大團(tuán)蜜露”水蜜桃摘自上海市南匯區(qū)果園，當(dāng)天運(yùn)至上海大學(xué)，選取果型端正、大小均一、無機(jī)械損傷的約七成熟果實(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不進(jìn)行任何消毒，直接進(jìn)行后續(xù)處理。

引物P0與P6 生工生物工程（上海）股份有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系各種試劑 寶日醫(yī)（TaKaRa）生物技術(shù)（北京）有限公司；DNA回收試劑盒 上海英駿生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

756CRT紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；CHA-213型雙目生物顯微鏡 日本Olympus儀器有限公司；C1000 Touch PCR儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；Tanon EPS300電泳儀 上海天能科技有限公司；AlphaImager Mini凝膠成像系統(tǒng) 美國ProteinSimple公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

牛肉膏蛋白胨（luria-bertani，LB）固體與液體培養(yǎng)基以及葡萄糖馬鈴薯（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基均參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行配制。

1.3.2 生防菌CF-2的鑒定

1.3.2.1 CF-2形態(tài)特征鑒定

將菌株CF-2接種在LB培養(yǎng)基平板和斜面上，放入37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，參照文獻(xiàn)[15-16]對其進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色，觀察菌體形態(tài)及菌落特征。

1.3.2.2 CF-2生理生化性狀鑒定

耐鹽性測定、好氧性和厭氧性測定、檸檬酸鹽的利用、淀粉水解、V-P（Voges Proskauer）實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、接觸酶反應(yīng)，均參照文獻(xiàn)[15-17]進(jìn)行。各處理均設(shè)定3 次重復(fù)。

1.3.2.3 菌株CF-2 16S rDNA基因片段序列分析

參照文獻(xiàn)[1 8]的方法擴(kuò)增C F-2菌株的1 6 S r D N A片段。采用細(xì)菌通用引物P 0（5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和P6（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’），預(yù)期擴(kuò)增片斷大小為1 513 bp。PCR體系包括：Taq DNA聚合酶（5 U/μL）2 μL、10×PCR緩沖液5 μL、dNTPs（10 mmol/L）1 μL、引物P0/P6（10 μmol/L）各1 μL、模板DNA（約50 g/L）1 μL、ddH2O 39 μL；PCR總體系為50 μL。PCR程序?yàn)椋合壬郎刂?4 ℃保持3 min，循環(huán)為：94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、90 s，共計(jì)30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，15 min）后，在紫外燈下，切割擴(kuò)增片段，采用DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，并連接到載體pMD18-T vector上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)桿菌TOP10。用Amp抗性LB平板篩選陽性克隆，挑陽性克隆搖菌，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

將獲得的測序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行BLAST同源性分析，隨后利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行序列比對以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.3 CF-2生物學(xué)特性分析

1.3.3.1 CF-2種子培養(yǎng)液的制備

用接種環(huán)將在LB固體培養(yǎng)基上預(yù)先活化的CF-2接入滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并用無菌蒸餾水將濃度調(diào)至1×108CFU/L，即為CF-2種子培養(yǎng)液。

1.3.3.2 生長曲線的測定

接種1 mL CF-2種子培養(yǎng)液到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)，每隔3 h用分光光度計(jì)在625 nm波長處測吸光度，通過觀察其生長速度來確定進(jìn)一步測定吸光度的取樣間隔時(shí)間。以不接菌的LB液體培養(yǎng)基為對照，每處理3 個(gè)重復(fù)。

1.3.3.3 最適生長pH值的測定

將滅菌后的100 mL LB液體培養(yǎng)基分別調(diào)成pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，隨后分別接種1 mL CF-2種子培養(yǎng)液于100 mL調(diào)至不同pH值的LB液體培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)，24 h后用紫外-可見分光光度計(jì)在625 nm波長處測其吸光度。以不接菌的LB培養(yǎng)液為空白對照，每處理3 個(gè)重復(fù)。

1.3.3.4 最適生長溫度的測定

接種1 mL CF-2種子培養(yǎng)液于100 mL pH 7.0的LB液體培養(yǎng)基中，放置于20、28、30、37、40、45、50 ℃，150 r/min的搖床中培養(yǎng)，24 h后用分光光度計(jì)在625 nm波長處測其吸光度。以不接菌的LB培養(yǎng)液為空白對照，每處理3 個(gè)重復(fù)。

1.3.4 CF-2對病原真菌體外抑菌率的測定

采用平板對峙法測定抑菌率，用打孔器（直徑6 mm）打孔原病原真菌菌絲，放置于新鮮PDA平板中央，在接種真菌菌絲的右側(cè)距菌絲3 cm處劃線接種經(jīng)過24 h活化的CF-2，分別重復(fù)3 個(gè)平行，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時(shí)將4 種病原菌按相同菌落大?。ㄖ睆? mm）接在新鮮PDA平板上，并且不接種CF-2，在相同條件下一起培養(yǎng)作為空白對照。待空白對照組的菌落長滿整個(gè)平板時(shí)，分別用十字交叉法測量空白組與處理組菌絲直徑并計(jì)算抑菌率。抑菌率計(jì)算如式（1）所示：

1.3.5 CF-2不同組分液的體外抑菌效果及其無菌濾液的抗菌活性測定

1.3.5.1 CF-2 24 h發(fā)酵液的制備

接種1 mL CF-2種子培養(yǎng)液到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并用無菌蒸餾水將濃度調(diào)至1×108CFU/L，即為CF-2 24 h發(fā)酵液。

1.3.5.2 CF-2菌懸液與無菌濾液的制備

取適量CF-2 24 h發(fā)酵液置于10 mL的離心管中在10 000×g條件下4 ℃離心20 min后，分離上清液后收集沉淀菌體，利用無菌生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液）進(jìn)行稀釋。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)及無菌生理鹽水將菌落濃度調(diào)至1×108CFU/L，即為CF-2 24 h發(fā)酵液的菌懸液。將先前離心后所得到的上清液在相同條件下重新離心一次。然后用直徑35 mm、孔徑0.22 μm的濾膜過濾，即為CF-2 24 h發(fā)酵液的無菌濾液。

1.3.5.3 致病真菌孢子菌懸液的配制

將含有0.05% Tween 80的無菌蒸餾水加入已經(jīng)過預(yù)先培養(yǎng)的致病真菌PDA平板上，用接種環(huán)將斜面上的孢子刮下，并用8 層滅菌紗布進(jìn)行過濾，取其清液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并制成約1×104spores/mL濃度的孢子懸浮液，待用。

1.3.5.4 CF-2不同組分液的抑菌效果測定

將滅菌后的牛津杯置于新鮮PDA平板中心（直徑為90 mm），輕輕按壓，使其與PDA培養(yǎng)基充分接觸沒有空隙。隨后在與牛津杯成一條直線的兩側(cè)中心點(diǎn)（即左右各24.5 mm處）分別接入由6 mm打孔器打孔的病原菌絲。隨后將牛津杯中央注入100 μL的CF-2的24 h發(fā)酵液、菌懸液或無菌濾液，并且用無菌蒸餾水作空白對照。將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，7 d后測定其抑菌圈直徑大小。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.5.5 CF-2無菌濾液對致病真菌菌絲生長的抑制率測定

將CF-2無菌濾液與滅過菌且還未凝固的PDA固體培養(yǎng)基以1∶5（V/V）混合，混合均勻后倒平板，配制成每個(gè)平板為20 mL的抗性培養(yǎng)基，空白處理則加入等量無菌水替代CF-2無菌濾液。晾干后在平板中央接入由6 mm打孔器所打的致病真菌菌絲，將平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，7 d后測定菌絲生長長度。每種病原菌每個(gè)處理重復(fù)3 次。抑菌率計(jì)算公式參考1.3.1節(jié)。

1.3.5.6 CF-2無菌濾液對致病真菌孢子萌發(fā)的抑制率測定

將20 mL含有CF-2無菌濾液的拮抗培養(yǎng)基（CF-2無菌濾液與PDA固體培養(yǎng)基體積比1∶4）倒入經(jīng)過滅菌的平板中，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將20 μL的致病真菌孢子菌懸液均勻涂抹在固體培養(yǎng)基上。對照組則是20 mL用無菌蒸餾水替代CF-2無菌濾液的普通培養(yǎng)基（無菌蒸餾水與PDA固體培養(yǎng)基體積比1∶4）。將平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每種病原菌每個(gè)處理重復(fù)3 次。用光學(xué)顯微鏡觀察處理組與空白對照組的孢子萌發(fā)情況，以芽管長度超過孢子最大直徑長度作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。觀察時(shí)間間隔為2 h，并且在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中適當(dāng)延長了觀察時(shí)間間隔，當(dāng)有孢子萌發(fā)則以該時(shí)間點(diǎn)作為開始萌發(fā)時(shí)間。另外，分別在6 d與12 d觀察并計(jì)數(shù)處理組與空白對照組的孢子萌發(fā)個(gè)數(shù)，計(jì)算孢子萌發(fā)率。孢子萌發(fā)率計(jì)算如式（2）所示：

1.3.6 CF-2及其代謝產(chǎn)物對水蜜桃貯藏保鮮效果分析

CF-2 24 h發(fā)酵液、菌懸液、無菌濾液及無菌水（空白對照）處理水果，每組24 個(gè)桃子，每個(gè)處理設(shè)3 組平行。水果處理采用噴霧方法，確保不同組分液均勻覆蓋每個(gè)桃子表面，晾干后，將水蜜桃輕輕放入保鮮盒，裝入保鮮袋以保持濕度，然后將水果置于恒溫儲藏間進(jìn)行貯藏，貯藏溫度為25 ℃，周期為6 d。每天測定好果率，6 d后結(jié)束貯藏。以未發(fā)生病害、冷害、機(jī)械性損傷、霉變的果實(shí)為好果。好果率計(jì)算如式（3）所示：

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株CF-2的鑒定

2.1.1 形態(tài)特征及染色結(jié)果

CF-2菌株在LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h后，鏡檢，菌體細(xì)胞呈桿狀，能運(yùn)動(dòng)。如圖1所示，經(jīng)革蘭氏染色顯紫色，呈陽性（以大腸桿菌為對照），且有綠色芽孢。如圖2所示，在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落呈淡黃色，略隆起，圓形，邊緣不整齊，呈放射狀。

圖2 CF-2在LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain CF-2 on LB solid culture after 24 h cultivation

2.1.2 生理生化特性

表1 CF-2生理生化特性Table1 Physiological and biochemical characteristics of strain CF-2

如表1所示，CF-2具有運(yùn)動(dòng)性，在氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～7%的情況下可以生長，能水解淀粉，能液化明膠，無法在厭氧條件下生長，能利用葡萄糖產(chǎn)酸但不能產(chǎn)氣，能利用檸檬酸鹽，V-P實(shí)驗(yàn)呈陽性反應(yīng)，接觸酶呈陽性反應(yīng)，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）特征一致。

2.1.3 16S rDNA同源性鑒定

利用引物P0和P6，擴(kuò)增出CF-2的16S rDNA片段，其長度為1 516 bp，比預(yù)期1 513 bp多3 bp，分析得知多出的3 bp均發(fā)生在重復(fù)序列處，由測序誤差產(chǎn)生。通過BLAST分析，擴(kuò)增的片段序列與枯草芽孢桿菌的16S rDNA部分序列的同源性達(dá)99%以上。隨后利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建出系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果顯示CF-2與枯草芽孢桿菌的遺傳距離最近，再一次證實(shí)生防菌CF-2屬于枯草芽孢桿菌。

圖3 CF-2的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain CF-2

2.2 菌株CF-2生物學(xué)特性

2.2.1 CF-2生長曲線

圖4 CF-2生長曲線Fig.4 Growth curve of strain CF-2

從圖4可看出，CF-2在LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，培養(yǎng)液的吸光度最大。CF-2在接種到LB培養(yǎng)液后的24 h內(nèi)處于對數(shù)生長期，24～48 h內(nèi)處于穩(wěn)定生長期，接種51 h后進(jìn)入衰老期?？梢娫摼L速度較快，接種后24～48 h內(nèi)菌量最多。

2.2.2 pH值對CF-2生長的影響

由圖5可看出，該菌在較大pH值范圍內(nèi)都能生長，但pH值對CF-2菌株生長影響明顯。其中pH 5.0～9.0適宜CF-2的生長，而CF-2最適pH值在7.0左右，可見該菌適宜在中性條件下生長。

圖5 pH值對CF-2生長的影響Fig.5 Influence of pH value on growth of strain CF-2

2.2.3 溫度對CF-2生長的影響

圖6 溫度對CF-2生長的影響Fig.6 Effects of temperature on growth of strain CF-2

由圖6可看出，溫度對生防菌CF-2生長和繁殖有明顯的影響，在20～50 ℃范圍內(nèi)，CF-2生長和繁殖速率呈先上升后下降趨勢，最適溫度為37 ℃左右。

2.3 菌株CF-2對病原真菌的抑制作用

2.3.1 CF-2對病原真菌的體外抑制效果

圖7 CF-2對病原菌的體外抑制率Fig.7 Inhibition rates of CF-2 on four fungal pathogens in vitro

由于4 種病原真菌生長速度不一，待空白對照組PDA平板上長滿真菌菌落后測定空白組與接種組平板上的菌絲直徑。在本實(shí)驗(yàn)中，分別于桃褐腐菌生長4 d后，絲核菌與復(fù)端孢霉生長6 d后，交鏈孢霉生長7 d后進(jìn)行測定。由圖7可知，CF-2對供試病原菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，平均抑制率為（38.70±9.22）%。其中對復(fù)端孢霉的抑制作用最大，抑制率為（52.30±3.67）%，其次是對絲核菌、交鏈孢霉與桃褐腐菌，抑制率分別為（37.63±3.28）%、（35.93±2.71）%與（28.94±1.65）%。該結(jié)果表明，CF-2對于桃果實(shí)采后常見病原真菌具有抑制作用。

2.3.2 CF-2不同組分液的體外抑菌效果及其無菌濾液的抗菌活性

2.3.2.1 CF-2不同組分液對菌絲生長的影響

為進(jìn)一步研究CF-2菌體以及代謝產(chǎn)物對4 種病原真菌的抑菌效果，將CF-2的24 h發(fā)酵液分離成只含有菌體的菌懸液及只含有代謝物質(zhì)的無菌濾液，測定該3 種組分液對真菌的抑制作用，從圖8可看出，菌株CF-2 24 h發(fā)酵液、菌懸液及無菌濾液對4 種病原菌均具有一定的抑制作用，其中無菌濾液對桃褐腐菌、絲核菌、復(fù)端孢霉與交鏈孢霉的抑菌圈直徑分別為（10.08±0.82）、（1 3.5 3±1.4 3）、（2 6.1 9±1.4 2）m m及（12.82±0.61）mm，抑菌作用較好，說明CF-2的代謝產(chǎn)物中含有抑菌物質(zhì)。

圖8 CF-2不同組分液對病原真菌的影響Fig.8 Inhibition zone diameters of fungal pathogens when exposure to the fermented both of CF-2 and its cell-free filtrate and cell suspension

2.3.2.2 CF-2無菌濾液對菌絲生長的影響

為進(jìn)一步探究CF-2代謝產(chǎn)物對4 種病原真菌菌絲生長的抑制效果，為后續(xù)的應(yīng)用提供根據(jù)，將僅含有代謝產(chǎn)物的無菌濾液添加進(jìn)PDA培養(yǎng)基中制成拮抗培養(yǎng)基，觀察菌絲生長的情況。在病原真菌接種7 d后，交鏈孢霉、絲核菌、桃褐腐菌和復(fù)端孢霉的空白對照組菌落直徑已經(jīng)分別長滿整個(gè)平板（9 cm），而添加無菌濾液的培養(yǎng)基中交鏈孢霉、絲核菌、桃褐腐菌和復(fù)端孢霉菌落直徑分別為（1.9±0.1）、（3.0±0.1）、（3.0±0.1）cm和（3.1±0.1）cm，可見添加無菌濾液的抗性培養(yǎng)基菌落直徑明顯小于空白對照組；如圖9所示，CF-2無菌濾液對桃褐腐菌、絲核菌、復(fù)端孢霉、交鏈孢霉的抑制率分別為（67.22±2.68）%、（6 5.2 3±3.4 7）%、（6 5.1 9±2.6 3）%、（77.41±1.91）%，平均抑制率達(dá)到（68.76±5.77）%，說明CF-2經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能顯著抑制致病真菌的生長，尤其是對交鏈孢霉的抑制效果最為明顯。

圖9 CF-2無菌濾液對病原菌菌絲生長的影響Fig.9 Inhibition rates of the cell-free filtrate of CF-2 on fungal pathogens in vitro

2.3.2.3 CF-2無菌濾液對病原菌孢子萌發(fā)率的影響

為進(jìn)一步探究CF-2代謝產(chǎn)物對于4 種病原真菌孢子萌發(fā)的作用，將僅含有代謝產(chǎn)物的無菌濾液添加進(jìn)PDA培養(yǎng)基中制成拮抗培養(yǎng)基，觀察孢子萌發(fā)的情況。孢子不萌發(fā)，說明其抑制效果良好，而萌發(fā)的越早，說明其抑制效果越差，反之說明其抑制效果越好，因此通過測定CF-2無菌濾液對病原真菌孢子萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)率的影響可直接反映其抑制效果。由于絲核菌不產(chǎn)孢子，因此研究中只測定了無菌濾液對交鏈孢霉、桃褐腐菌和復(fù)端孢霉孢子萌發(fā)的影響。

表2 CF-2無菌濾液對病原真菌孢子開始萌發(fā)時(shí)間的影響Table2 Effect of the cell-free filtrate of CF-2 on starting time of spore germination

如表2所示，空白對照組中的交鏈孢霉、桃褐腐菌與復(fù)端孢霉的孢子分別在12、8 h與14 h后開始萌發(fā)，但經(jīng)過CF-2無菌濾液處理后交鏈孢霉、桃褐腐菌與復(fù)端孢霉的孢子萌發(fā)時(shí)間分別延遲至74、72 h與76 h，較空白對照組延長了62、64 h與62 h。

表3 CF-2無菌濾液對病原菌孢子萌發(fā)率的影響Table3 Effect of the cell-free filtrate of CF-2 on spore germination rate%

由表3可知，12 d后，經(jīng)CF-2無菌濾液處理的交鏈孢霉、桃褐腐菌與復(fù)端孢霉的孢子萌發(fā)率分別為8.45%、9.25%和9.64%，較空白對照組分別降低了91.55%、87.27%與84.97%，平均降低了87.93%。由此可知，添加CF-2無菌濾液可有效降低病原菌孢子萌發(fā)率。

以上結(jié)果表明，CF-2的無菌濾液可以使病原真菌的菌絲生長受到抑制，使病原菌孢子在適宜條件下不能正常萌發(fā)，說明CF-2的代謝產(chǎn)物對病原菌的生長和代謝產(chǎn)生了抑制作用；同時(shí)CF-2無菌濾液對4 種不同病原菌的抑制效果不同，對交鏈孢霉的抑制效果最好。

2.4 CF-2組分液對水蜜桃采后的保鮮效果

為明確CF-2在水果上的實(shí)際應(yīng)用效果，研究在25 ℃常溫條件下CF-2不同組分液對水蜜桃采后的保鮮作用，從圖10可看出，在第3天時(shí)，空白對照組已出現(xiàn)腐爛的果實(shí)，其他經(jīng)過CF-2組分液噴灑處理與空白對照有顯著性差異（P＜0.05）；在第4天時(shí)，CF-2 24 h發(fā)酵液處理的果實(shí)開始出現(xiàn)腐爛，而CF-2無菌濾液與CF-2菌懸液處理的果實(shí)未腐爛，保鮮效果與發(fā)酵液差異顯著（P＜0.05）；到第6天時(shí)，CF-2 24 h發(fā)酵液、無菌濾液與菌懸液處理組的好果率顯著高于空白對照組，其中無菌濾液處理組的好果率最高，顯著高于其他處理組（P＜0.05），說明在室溫下，CF-2 24 h發(fā)酵液及無菌濾液與菌懸液對水蜜桃均有顯著的保鮮效果，其中無菌濾液的效果最好，第6天時(shí)無菌濾液處理組好果率為（95.5±1.9）%，較空白對照組（66.5±1.7）%提高29%。

圖10 CF-2組分液對采后水蜜桃好果率的影響Fig.10 Effects of the fermented both of CF-2 and its cell-free filtrate and cell suspension on percentage of marketable fruit

3 討 論

細(xì)菌形態(tài)和生理生化特征鑒定是細(xì)菌現(xiàn)代分類鑒定重要的依據(jù)[19]。本研究通過形態(tài)學(xué)和生理生化方法，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[17]中有關(guān)芽孢桿菌種屬鑒別特征的描述，確定CF-2菌株為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）。在此基礎(chǔ)上，利用16S rDNA基因序列比對分析法，在分子生物學(xué)水平上對CF-2進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，最終確定其為枯草芽孢桿菌。

枯草芽孢桿菌作為一株已被廣泛研究的生防菌，已有大量報(bào)道證明了其抗真菌作用。關(guān)一鳴等[20]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B11使灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）與腐皮鐮刀菌（Fusarium solani (Mart.) App. et Wollenw.）生長受到影響。韓雨桐等[21]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌Sc2可以抑制稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的生長。本研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌CF-2的菌體在體外對供試的4 種病原菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用。

另外，枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物也被報(bào)道具有抑制真菌的能力。例如：枯草芽孢桿菌EA-CB0015的菌體本身與無菌濾液對灰葡萄孢霉與刺盤孢屬（Colletotrichum sp.）均有不同程度的抑制作用[22]；枯草芽孢桿菌V26的無菌濾液可抑制灰葡萄孢霉[23]與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）[24]的菌絲生長。本研究中，CF-2的無菌濾液可極強(qiáng)地抑制4 種病原真菌菌絲的生長。另外，枯草芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物對于真菌孢子萌發(fā)方面也有相關(guān)報(bào)道：關(guān)一鳴等[20]報(bào)道枯草芽孢桿菌B11代謝產(chǎn)物原液對于灰葡萄孢霉與腐皮鐮刀菌的孢子萌發(fā)抑制率均超過85%。劉詩胤[25]分離獲得12 株可以拮抗稻瘟病菌的細(xì)菌，其中有7 株枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)液100%抑制稻瘟病菌分生孢子的萌發(fā)。李晶等[26]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B29分泌的抗菌物質(zhì)可以抑制尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）孢子的萌發(fā)。本研究結(jié)果也說明CF-2代謝產(chǎn)物極大地延長了真菌孢子的萌發(fā)時(shí)間，并且能夠使病原真菌孢子在適宜條件下無法正常萌發(fā)。

同時(shí)，在實(shí)體實(shí)驗(yàn)方面，枯草芽孢桿菌亦體現(xiàn)出良好的生防能力。候旭等[27]從桃樹根部組織中復(fù)篩分離得到3 株枯草芽孢桿菌，并通過桃果實(shí)實(shí)體實(shí)驗(yàn)證明該3 株枯草芽孢桿菌能夠抑制桃褐腐病的發(fā)生，提高好果率。本實(shí)驗(yàn)中，CF-2與其代謝產(chǎn)物可以在室溫下顯著提高桃果實(shí)的好果率，延緩腐敗的發(fā)生，對桃果實(shí)的保鮮作用明顯。

綜上所述，CF-2及其代謝產(chǎn)物對采后水蜜桃病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，與農(nóng)藥相比有保護(hù)環(huán)境、安全等優(yōu)點(diǎn)，是一株具有廣闊應(yīng)用前景的生防菌株。因此，進(jìn)一步對CF-2的抑菌機(jī)理及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，將為生物防治的研究展開一條全新的思路。

4 結(jié) 論

對1 株分離自豆腐乳的生防菌株CF-2進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征鑒定，同時(shí)通過16S rDNA基因序列分析法進(jìn)行分子鑒定，確定該菌為枯草芽孢桿菌，該菌24～48 h繁殖速度最旺盛，最適生長pH 7.0，最適生長溫度為37 ℃。

CF-2對4 種病原真菌在體外均有抑制作用，平均抑制率為（38.70±9.22）%，其中對復(fù)端孢霉的抑制作用最大，抑制率為（52.30±3.67）%。CF-2 24 h發(fā)酵液及無菌濾液與菌懸液對4 種病原菌均有較強(qiáng)的抑制效果，其中無菌濾液對4 種病原真菌的平均抑制率為（68.76±5.77）%，無菌濾液對交鏈孢霉的抑制作用最大，抑制率為（77.41±1.91）%；經(jīng)過CF-2無菌濾液處理后，真菌孢子萌發(fā)時(shí)間較空白對照組均延長62～64 h，12 d后孢子萌發(fā)率較空白對照組平均降低87.93%；在實(shí)體實(shí)驗(yàn)中，25 ℃室溫CF-2 24 h發(fā)酵液及無菌濾液與菌懸液對水蜜桃的保鮮效果非常明顯，可有效提升好果率，其中無菌濾液效果最好，第6天時(shí)較空白對照組好果率提升了29%，表明CF-2及其代謝產(chǎn)物對4 種水蜜桃采后病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)對水蜜桃采后抑制腐爛效果明顯。