雨生紅球藻多糖的分離純化和免疫活性組分鑒定

劉 涵，張 苗，劉曉娟，曹 庸

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis），又稱湖生紅球藻或湖生血球藻，是一種單細胞綠藻，被認為是繼螺旋藻、小球藻之后的又一高經(jīng)濟價值的微藻，富含蝦青素、多糖、蛋白質(zhì)、維生素和微量元素等營養(yǎng)成分，2010年被國家衛(wèi)生和計劃生育委員會批準(zhǔn)為新食品原料[1]。目前雨生紅球藻的研究主要集中在蝦青素的高效生產(chǎn)，提取完蝦青素后的藻渣作為動物飼料或直接丟棄，雨生紅球藻資源未得到充分利用。雨生紅球藻中碳水化合物所占比例較高，約占細胞干質(zhì)量的30%～40%，且多糖含量高達干質(zhì)量的6%～10%，多糖基本上都保留在脫脂后的藻渣中，因此對其進一步高值化開發(fā)利用具有重要意義。

近些年來，微藻多糖由于資源豐富、具有獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性等備受關(guān)注。目前國內(nèi)外報道的藻類多糖主要有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗腫瘤、降血脂、增強免疫等生物活性[2-7]，其中增強機體免疫力是大多數(shù)多糖包括微藻多糖所具有的生物活性。大量研究發(fā)現(xiàn)湖泊紅球藻（Haematococcus lacustris）、小球藻（Chlorella）、紫球藻（Porphyridium cruentum）、綠色巴甫藻（Pavlova viridis）等微藻多糖均能促進脾淋巴細胞的增值，增強吞噬細胞的吞噬作用，促進巨噬細胞合成NO發(fā)揮正向免疫調(diào)節(jié)功能[8-11]。綠藻（Coccomyxa gloeobotrydiformis）中提取的多糖AEX可以促進細胞外的抗原呈遞，抑制細胞內(nèi)的抗原呈遞，激活雞外周血分子細胞PBMCs反應(yīng)[12]。螺旋藻（Spirulina）水提物可增加免疫功能低下小鼠免疫器官質(zhì)量，促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化，提高NK細胞活性，還能增強慢性乙型肝炎患者外周血單個核細胞的增殖能力，上調(diào)慢性乙型肝炎患者外周血單個核細胞IFN-γm RNA的表達[13-14]。

關(guān)于雨生紅球藻多糖的研究還十分有限，有研究表明超聲輔助堿提雨生紅球藻多糖對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基有較好的清除效果，清除率達60%以上[15]，還有研究報道雨生紅球藻多糖具有促血栓溶解活性[16]。雨生紅球藻胞外多糖以劑量依賴性方式抑制BGC-823和HL60細胞的生長，在2 mg/mL時抑制率分別為68%和40%[17]。本研究以蝦青素提取后的雨生紅球藻渣為原料，在體外免疫細胞模型活性跟蹤下，對超聲輔助提取的雨生紅球藻粗多糖（Haematococcus pluvialis polysaccharide，HPP）進一步采用DEAE-52纖維素陰離子交換柱層析和Sephacryl S400葡聚糖凝膠柱層析進行分離純化，使用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法測定各組分多糖分子質(zhì)量，對免疫活性組分進行鑒定，研究結(jié)果為雨生紅球藻的高值化綜合利用提供了有利指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雨生紅球藻渣 荊州天然蝦青素有限公司；BALB/c小鼠，雄性，6～8 周（許可證號：SCXK粵2016-0041）南方醫(yī)科大學(xué)SPF級實驗動物中心；胎牛血清 杭州四季青生物有限公司；青-鏈霉素溶液、無酚紅RPMI1640美國Gibco公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、0.4%臺盼藍、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司；DEAE-52纖維素 英國Whatman公司；Sephacryl S400 美國GE公司；丙烯酰胺、高碘酸、無水乙醇、濃硫酸、碳酸氫銨、苯酚均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104萬分之一電子天平、DELTA320 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JY92-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 鞏義予華儀器有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市英峪高科儀器廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；FD-1冷凍干燥機 北京博醫(yī)康技術(shù)公司；DHG-970電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊心科學(xué)儀器有限公司；UV3010紫外分光光度計 日本日立高科技公司；TGL-16G高速臺式離心機 上海安亭儀器廠；Φ1.6 cm×60 cm層析柱上海精科實業(yè)有限公司；LC-10A Tvp Plus分析高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 HPP的提取

稱取5.0 g干燥的雨生紅球藻渣，加入125 mL蒸餾水，在超聲功率400 W條件下提取30 min，然后置于90 ℃恒溫水浴浸提3 h，冷卻，4 000 r/min離心10 min，取上清液濃縮，加入4 倍體積無水乙醇，靜置過夜，再經(jīng)4 000 r/min離心10 min后取沉淀，用無水乙醇洗滌，冷凍干燥得HPP[18]。

1.3.2 HPP的分離純化

1.3.2.1 DEAE-52纖維素柱層析法

將活化好的DEAE-52纖維素填料，用2～3 倍柱體積的蒸餾水以1.5 mL/min流速沿著玻璃棒緩慢均勻的流入層析柱（3.0 cm×35 cm）平衡6 h。配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL HPP溶液10 mL上樣。梯度洗脫采用蒸餾水、0.1、0.3、0.5、1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速為2 mL/min，每10 mL收集一管，恒流泵自動加入緩沖液。以硫酸-苯酚法追蹤檢測多糖流出，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制多糖分級流出的出峰圖譜[19]。每個峰收集為一個組分，每個組分注入3 500 Da透析袋進行透析，以蒸餾水作為外部滲透液，48 h透析完全，用0.1 mol/L的AgNO3溶液檢測滲出液Cl－殘留。透析后樣品溶液濃縮凍干備用，并用HPGPC測定柱層析后分部收集的各多糖組分分子質(zhì)量分布范圍。

1.3.2.2 Sephacryl S400凝膠柱層析法

將Sephacryl S400凝膠填料純水浸泡過夜使其充分溶脹后填裝柱（1.6 cm×70 cm），上樣方法同DEAE-52纖維素柱。配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL HPP-c3多糖溶液1 mL上樣。以0.1 mol/L碳酸氫銨溶液為洗脫液，流速為0.3 mL/min，每5 mL收集一管，恒流泵自動加入洗脫液。以硫酸-苯酚法追蹤檢測多糖的流出，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制多糖的出峰圖譜。隔管采用HPGPC檢測并根據(jù)HPGPC圖譜合并洗脫液，濃縮凍干合并液得到各多糖組分[20]。

1.3.3 HPP增強免疫活性的測定

1.3.3.1 脾細胞懸液的制備

小鼠脫頸處死，75%乙醇溶液浴10 min后置于超凈工作臺。取出脾臟，放于盛有5 mL預(yù)冷的RPMI-1640完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用1 mL注射器從培養(yǎng)皿中吸取完全培養(yǎng)液，將針頭縱向扎入脾臟內(nèi)部，反復(fù)抽吸幾次，獲取足量脾細胞，剩余脾臟用一次性玻璃注射器芯輕輕研磨。將50 mL離心管口套一張200 目不銹鋼篩（無菌），然后將脾細胞懸液過篩轉(zhuǎn)移至離心管，1 000 r/min離心8 min，棄去上清液[21]。向細胞沉淀加入5 mL預(yù)冷的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液，用臺盼藍染色法進行活細胞計數(shù)。用預(yù)冷的RPMI-1640完全培養(yǎng)基稀釋調(diào)整細胞密度至1.0×107～1.2×107個/mL。

1.3.3.2 接種培養(yǎng)

取96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入細胞懸液50 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取出細胞培養(yǎng)板，空白對照組加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基25 μL，樣品組每孔加入不同質(zhì)量濃度樣品溶液25 μL，各多糖組分終質(zhì)量濃度為3.9、7.8、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1 000 μg/mL，再加入完全培養(yǎng)基25 μL，使每孔體積100 μL。每個質(zhì)量濃度樣品設(shè)6 個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h。

1.3.3.3 MTT活性檢測

在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加MTT溶液20 μL。繼續(xù)孵育4 h后終止培育。將96 孔板3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩5 min，使結(jié)晶物充分融解。測定波長570 nm處各孔光密度值，以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，刺激指數(shù)為縱坐標(biāo)繪制免疫調(diào)節(jié)效果圖[22-23]。刺激指數(shù)按下式計算：

1.3.4 HPP-c3-s1純度和分子質(zhì)量檢測

1.3.4.1 全波長掃描

將HPP-c3-s1配制成0.1 mg/mL，使用紫外分光光度計進行全波長掃描。

1.3.4.2 HPGPC法測定

將相對分子質(zhì)量為5 000、12 000、25 000、50 000、8 0000、150 000、270 000、410 000、670 000的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，用流動相配制成4.0 mg/mL的溶液，并過0.22 μm水相濾頭，進樣量20 μL，檢測時間45 min，記錄色譜圖。得到葡聚糖相對分子質(zhì)量對數(shù)lgM與洗脫體積的曲線，并對曲線進行二次回歸擬，得出與曲線相關(guān)度較好的葡聚糖HPGPC校正曲線，用于確定被測樣品中多糖分子質(zhì)量分布范圍[24]。HPGPC校正曲線方程為y=0.225 6x2－5.135 7x+33.715（x為葡聚糖相對分子質(zhì)量對數(shù)lgM，y為洗脫體積），線性相關(guān)系數(shù)R2為0.988 7。將柱層析后分部收集的各HPP組分用流動相配成一定質(zhì)量濃度的樣液，過0.22 μm水相濾頭，進行色譜分析。

1.3.4.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳法

取HPP-c3-s1樣品1 mg，加入硼酸緩沖液0.1 mL溶解。以3∶1的比例與上樣緩沖液混合，振蕩完全溶解后10 000 r/min離心5 min，取上清液得供試品溶液。用移液槍移取10 μL供試品溶液到上樣孔。電泳開始時，用40 V恒壓電泳20 min，后加大電壓至110 V恒壓電泳1 h。電泳結(jié)束后，經(jīng)過漂洗、高碘酸氧化、染色和脫色后拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 利用DEAE-52纖維素柱層析對HPP進行分離純化

2.1.1 HPP的DEAE-52纖維素柱層析洗脫曲線

圖 1 HPP的DEAE-52纖維素柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution curve of Haematococcus pluvialis polysaccharides (HPPs)on DEAE-52 cellulose column

從粗多糖中得到均一高純度活性多糖組分的分離純化方法很多，主要包括沉淀法、膜分離法和柱層析法等。柱層析法主要有離子交換柱層析、凝膠滲透柱層析和親和層析法等。目前，陰離子交換柱層析是多糖分離純化應(yīng)用最廣泛的一種方法。陰離子交換柱層析法機理是吸附與解吸附[25]，吸附力隨著活性多糖分子中酸性基團的增加而增加[26]，帶電荷量少的偏中性的多糖最先被洗脫下來，所帶電荷量越大，與纖維素填料的結(jié)合越緊密，越難被洗脫[27]。洗脫方式分為蒸餾水洗脫、不同鹽離子濃度洗脫和不同pH值緩沖鹽洗脫，用pH值相同而離子濃度不同的緩沖液可將酸性強弱不同的多糖分別洗脫出來，體積大的酸性、中性和黏多糖可先用陰離子交換柱層析初步分離純化[28]。常用的陰離子交換劑有DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖和DEAE-瓊脂糖，其中以DEAE-纖維素應(yīng)用最廣泛[29-32]。本實驗首先采用DEAE-52纖維素柱層析對HPP進行分離純化。由圖1可以看出，HPP經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析得到5 個洗脫峰。當(dāng)采用蒸餾水洗脫時，HPP-c1最先被洗脫下來，是中性糖，質(zhì)量高達45.7 mg，所占比例為68.83%。當(dāng)NaCl濃度為0.1、0.3、0.5 mol/L和1 mol/L時均有多糖被洗脫下來，分別為HPP-c2（6.5 mg）、HPP-c3（7 mg）、HPP-c4（4.8 mg）和HPP-c5（2.4 mg），是酸性多糖，其中0.3 mol/L NaCl洗脫得到的HPP-c3含量最高，所占比例為10.54%，1 mol/L NaCl洗脫得到的HPP-c5含量最低，僅占3.61%。因此，雨生紅球藻多糖中含有中性多糖和酸性多糖，并且以酸性多糖為主。

圖2 DEAE-52柱層析各多糖組分的HPGPC圖譜Fig.2 GPC chromatogram of HPPs on DEAE-52 cellulose column

2.1.2 HPP各多糖組分的HPGPC圖譜采用HPGPC鑒定HPP經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析分離后的5 種多糖組分的純度，如圖2所示。結(jié)果表明，

HPP-c1、HPP-c2、HPP-c3、HPP-c4和HPP-c5五種多糖組分的HPGPC圖譜均呈現(xiàn)2 個以上峰，峰形寬并且不對稱，從而推斷5 種多糖組分均是由幾種多糖組成的混合物。因此，單獨采用DEAE-52纖維素作為介質(zhì)進行分離純化不能得到雨生紅球藻均一多糖，后續(xù)將進一步采用凝膠柱進一步進行分離純化。

2.1.3 HPP各多糖組分單獨刺激對小鼠脾細胞增殖的影響

圖3 HPP各多糖組分單獨刺激對小鼠脾細胞增殖的影響Fig.3 Stimulating effects of crude HPPs and fractions on mouse spleen cell proliferation

采用體外免疫細胞模型進行活性跟蹤，對HPP經(jīng)DEAE-52柱層析后各多糖組分的免疫活性進行檢測，從而得到免疫活性較高的組分進行后續(xù)的分離純化。由圖3可知，在3.9～125 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，HPP和DEAE-52柱層析后各多糖組分（HPP-c1、HPP-c2、HPP-c3、HPP-c4和HPP-c5）均具有刺激小鼠脾細胞增殖的作用，在質(zhì)量濃度250～1 000 μg/mL時，HPP各多糖組分對小鼠脾細胞的增殖均具有不同程度的抑制作用。由于多糖對脾細胞的促增值作用存在最適劑量，超過最適劑量可能導(dǎo)致毒性作用，從而使脾細胞增殖能力下降。由圖3可知，HPP-c3、HPP-c4和HPP-c5在質(zhì)量濃度為3.9～125 μg/mL時的刺激指數(shù)較HPP-c1和HPP-c2高。大量研究表明，酸性多糖往往具有更好的活性[33]。在DEAE-52柱層析得到的酸性多糖組分HPP-c3、HPP-c4和HPP-c5中，HPP-c3多糖質(zhì)量為7 mg，所占比例最高，其次為HPP-c4，HPP-c5質(zhì)量最低。綜合考慮多糖質(zhì)量和小鼠脾細胞增強免疫活性，后續(xù)采用HPP-c3進行進一步的分離純化。

2.2 Sephacryl S400凝膠柱層析分離純化

2.2.1 HPP-c3的Sephacryl S400凝膠柱層析洗脫曲線

圖4 HPP-c3的Sephacryl S400凝膠柱層析洗脫曲線Fig.4 Elution curve of HPP-c3 on Sephacryl S400 column

凝膠柱層析法類似于分子篩作用，采用去離子水或稀鹽溶液為洗脫液，可進一步將多糖按相對分子質(zhì)量大小和不同形狀分離出來[34]。常用的凝膠填料有羥丙基葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠和丙烯葡聚糖凝膠（Sephacryl）等。Sephacryl是一種新型葡聚糖凝膠，它具有分離范圍大、耐高溫及較高壓力、化學(xué)和機械穩(wěn)定性好、適用于大部分溶劑等優(yōu)點，且其穩(wěn)定的工作pH值范圍較大，一般為3～11，因此可以快速、高效地實現(xiàn)多糖的分離純化。有研究者將龍須菜粗多糖和蜈蚣藻粗多糖經(jīng)Sephacryl凝膠色譜柱分離純化均獲得了活性組分[35-36]。本實驗采用Sephacryl S400對免疫活性較高且含量最多的HPP-c3進一步進行分離純化，如圖4所示。HPP-c3經(jīng)過超純水洗脫后，大致分成3 個區(qū)段，第1區(qū)段組分HPP-c3-s1（8～14 管）最先被洗脫出來，接著是第2區(qū)段組分HPP-c3-s2（15～20 管），最后為第3區(qū)段組分HPP-c3-s3（21～25 管）。

2.2.2 HPP-c3的各亞組分HPGPC圖譜

圖5 HPP-c3的Sephacryl S400凝膠柱層析各多糖組分HPGPC圖譜Fig.5 HPGPC chromatograms of HPP-c3 fractions on Sephacryl S400 column

由圖5可知，HPP-c3經(jīng)過凝膠柱層析得到3 個多糖組分HPP-c3-s1、HPP-c3-s2和HPP-c3-s3。其中，HPP-c3-s1組分的峰形單一，均勻?qū)ΨQ，分子質(zhì)量集中；HPP-c3-s2組分的峰形對稱性不好；HPP-c3-s3組分峰形不單一，多于2 個峰，且多糖含量最低，后續(xù)實驗不予考慮。

2.2.3 HPP-c3的各亞組分單獨刺激對小鼠脾細胞增殖的影響

圖6 HPP-c3的各亞組分單獨刺激對小鼠脾細胞增殖的影響Fig.6 Stimulating effects of HPP-c3 fractions on proliferation of mouse spleen cells

由圖6可知，HPP-c3多糖組分經(jīng)過進一步分離純化，其亞組分呈現(xiàn)出較高的增強免疫活性。其中HPP-c3-s1在0～250 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可以極顯著刺激小鼠脾細胞增殖（P＜0.01），并呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)，最高刺激指數(shù)達1.34。HPP-c3-s2在0～250 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)也可以刺激小鼠脾細胞增殖（P＜0.01），但在7.8～250 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，增殖刺激指數(shù)均低于HPP-c3-s1。因此，在體外免疫細胞模型活性跟蹤下，從雨生紅球藻中分離純化得到免疫活性較高的活性組分HPP-c3-s1。

對比圖6和圖3，HPP和DEAE-52纖維素柱層析初步分離的各多糖組分對小鼠脾細胞增殖的刺激指數(shù)較低，在3.9～125 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，刺激指數(shù)范圍在0.1～0.6之間。HPP-c3組分經(jīng)Sephacryl S400凝膠柱層析進一步分離純化后，小鼠脾淋巴細胞增殖的刺激指數(shù)顯著增大，在62.5～250 μg/mL范圍內(nèi)刺激指數(shù)均高于1.0，并呈劑量依賴性增大。從而說明采用DEAE-52纖維素柱層析和Sephacryl S400凝膠柱層析能夠有效地分離HPP的增強免疫高活性組分。由于DEAE纖維素陰離子柱層板分離多糖的原理主要是其可吸附離子型物質(zhì)，比如蛋白質(zhì)、酸性多糖等，大多數(shù)中性多糖可順利流出，其分離效果與柱高、洗脫溶劑、粒徑的關(guān)系很大，因此與凝膠柱層析結(jié)合使用能夠更加有效地進行微藻多糖的分離純化，在近些年來的研究中被廣泛運用。有研究者對采用了DEAE-52纖維素柱層析和SephadexG凝膠柱層析對球等鞭金藻（Isochrysis galbana）和紅江蘺（Gracilaria rubra）的多糖組分進行分離純化，得到具有抗氧化活性的多糖組分和免疫活性最高的多糖組分[37-38]。金色奧杜藻（Odontella aurita）和小球藻（Chlorella）也采用2 種凝膠柱層析結(jié)合的分離方法，得到了具有清除自由基功能成分的多糖組分[39-40]。

2.3 HPP-c3-s1的純度和分子質(zhì)量

均一多糖的制備是后續(xù)多糖結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對于揭示多糖的構(gòu)效關(guān)系至關(guān)重要。多糖的性質(zhì)和生物活性往往與其分子質(zhì)量及其分布有關(guān)，因此測定多糖的分子質(zhì)量非常重要。多糖的分子質(zhì)量只代表相似鏈長的平均分布，通常表示方式有重均分子質(zhì)量（mw）、數(shù)均分子質(zhì)量（mn）和黏均分子質(zhì)量（mv）等。目前測定方法主要有蒸汽壓法、光散射法、黏度法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、凝膠過濾法和HPGPC法等。這幾種方法中，HPGPC法是目前最常用也是公認較為正確的方法，具有快速、高分辨率和重復(fù)性好等優(yōu)點，因此在國內(nèi)外廣泛使用[41-44]。本研究采用全波長掃描、HPGPC法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法對HPP-c3-s1的純度進行鑒定，并檢測其分子質(zhì)量。

2.3.1 HPP-c3-s1的全波長掃描分析

圖7 HPP-c3-s1全波長掃描圖Fig.7 Ultraviolet absorption spectrum of HPP-c3-s1

由圖7可知，HPP-c3-s1沒有核酸（260 nm）和蛋白質(zhì)（280 nm）特征吸收峰，從而說明多糖HPP-c3-s1沒有核酸和蛋白質(zhì)干擾[45]。

2.3.2 HPP-c3-s1的純度和分子質(zhì)量檢測

圖8 HPP-c3-s1的HPGPC圖譜Fig.8 HPGPC chromatogram of HPP-c3-s1

根據(jù)分子尺寸排阻原理，將HPP-c3-s1經(jīng)過凝膠柱分離，用示差折光檢測器進行檢測。由圖8可知，HPP-c3-s1經(jīng)過HPGPC分析，HPP-c3-s1峰形均一并且對稱，從而推斷HPP-c3-s1為均一多糖。HPP-c3-s1的保留時間為12.633 min，根據(jù)HPGPC標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，得出HPP-c3-s1分子質(zhì)量為23 413 kDa。

2.3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定純度

圖9 HPP-c3-s1的電泳圖Fig.9 PAGE electrophoresis pattern of HPP-c3-s1

從圖9可知，HPP-c3-s1的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖成一條線狀，得到單一色帶，從而說明分離純化得到的HPP-c3-s1多糖是均一多糖。

3 結(jié) 論

在體外免疫細胞模型活性跟蹤下，HPP經(jīng)DEAE-52柱層析分離純化得到HPP-c1、HPP-c2、HPP-c3、HPP-c4和HPP-c5五個多糖組分，其中HPP-c3免疫活性較好且含量較高。HPP-c3經(jīng)Sephacryl S400柱層析得到HPP-c3-s1、HPP-c3-s2和HPP-c3-s3，其中HPP-c3-s1為均一多糖，且具有最高的增強免疫活性，分子質(zhì)量為23 413 kDa。HPP-c3-s1均一多糖的制備對于后續(xù)開展雨生紅球藻多糖構(gòu)效關(guān)系提供理論依據(jù)。