含殼聚糖和Nisin的復(fù)合襯墊對鮮肉的保鮮效果

何葉子，徐 丹,*，張春森，許琦煬

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué) 食品科學(xué)與工程國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶 400715）

豬肉由于含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪被認(rèn)為是人類必需的營養(yǎng)來源之一。中國城市人口的總?cè)忸愊M(fèi)中，豬肉占57%，而在農(nóng)村人口中更是高達(dá)71%[1]。在所消費(fèi)的豬肉中，新鮮豬肉憑其良好的口感和豐富的營養(yǎng)更受消費(fèi)者的歡迎。但新鮮豬肉即使在低溫下也極其容易受到微生物感染而發(fā)生氧化酸敗。因此，將具有抗菌和抗氧化功能的活性包裝系統(tǒng)運(yùn)用于肉類保鮮，可有效地延長其貨架期，從而減少鮮肉因變質(zhì)而造成的浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失。

具有抗菌或抗氧化效果的活性化合物可通過多種方式引入到包裝系統(tǒng)中，例如直接噴灑[2]，將揮發(fā)性活性化合物以小袋的形式置于包裝系統(tǒng)中[3]，也可將活性化合物通過物理混合或共價結(jié)合的方式引入包裝材料中[4-5]等。采用以上形式制備的活性包裝系統(tǒng)均能起到延長肉類保質(zhì)期的作用。但是以上包裝系統(tǒng)均無法有效吸收鮮肉溢出的汁液，而這些汁液如果殘留在包裝系統(tǒng)中，其中富含的大量營養(yǎng)成分會促進(jìn)病原體或腐敗微生物的繁殖[6]，同時也會對產(chǎn)品的外觀品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響。含有抗菌或抗氧化活性化合物的吸濕性襯墊則可有效地吸收肉汁，并釋放出活性物質(zhì)，從而有效地延長鮮肉的保質(zhì)期并提高消費(fèi)者接受度。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)將茶多酚加入復(fù)合襯墊中，利用其強(qiáng)抗氧化性可顯著延長鮮豬肉貨架期[7]。

本研究采用天然原料羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）、殼聚糖（chitosan，CS）、蒙脫土（montmorillonite，MMT）和乳酸鏈球菌素（Nisin）制備高吸濕性的抗菌襯墊。CMC-Na和CS都具有良好的生物相容性和生物可降解性，且CS具有一定的抗菌作用，對于減緩鮮肉的腐敗有一定效果[8]。MMT是目前應(yīng)用最廣泛的無機(jī)納米粒子之一，與聚合物共混時，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的MMT，使其均勻分布在集合物基體中，即可顯著提高襯墊的壓縮強(qiáng)度，并使其具有較高的吸濕速率[9]。Nisin是從乳酸鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物中得到的一種多肽抗菌素類物質(zhì)[10]，能有效抑制引起食品腐敗的革蘭氏陽性菌，如李斯特菌、金黃色葡萄球菌等[11]；作為一種安全的食品添加劑，它已被用于魚類[12]和乳制品[13]等的保鮮。將Nisin與其他保鮮劑如CS共同使用，可以進(jìn)一步擴(kuò)大其抗菌譜，增強(qiáng)活性[12]。

本研究將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Nisin添加到復(fù)合襯墊中，用于冷鮮豬肉的托盤包裝，通過測定各樣品在貯藏期間的菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、pH值、蒸煮損失率、硬度和顏色變化，以評價該復(fù)合襯墊對鮮肉的保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮肉為本地超市購買的當(dāng)天宰殺的新鮮后腿豬肉。

CS（脫乙酰度90.1%，相對分子質(zhì)量2×105）濰坊海之源生物制品有限公司；鈉基MMT 美國Nanocor公司；CaCl2（食品級） 浙江巨化股份新聯(lián)化工有限公司；Nisin 浙江新銀象生物工程有限公司；甲基紅、次甲基藍(lán)、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）（均為分析純）、CMC-Na（黏度≥1 200 mPa·s）成都市科龍化工試劑廠；硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）（分析純） 上?？曝S化學(xué)試劑有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂 杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-10型真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；SP-756P紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；CT3質(zhì)構(gòu)儀 美國博勒飛公司；5810型臺式高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 CMC-Na/CS/MMT/Nisin保鮮襯墊的制備

稱取2 g CMC-Na于100 mL去離子水中，攪拌至完全溶解。稱取0.6 g CS于60 mL體積分?jǐn)?shù)1%的乙酸溶液中，攪拌至完全溶解，然后與CMC-Na溶液混合，得到溶液A。稱取0.13 g MMT，分散于20 mL、體積分?jǐn)?shù)1%的乙酸溶液中，超聲30 min后加入到溶液A中，攪拌均勻，得到溶液B。根據(jù)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[14]中規(guī)定的預(yù)制肉類Nisin的最大添加量為0.5 g/kg（以鮮肉質(zhì)量計(jì)，下同），設(shè)置Nisin在豬肉中的添加量分別為0（CMC-Na/CS/MMT襯墊）、0.1、0.3 g/kg和0.5 g/kg。按照每個襯墊上放置30 g新鮮豬肉，計(jì)算每個襯墊中Nisin的添加量，準(zhǔn)確稱取后溶于10 mL去離子水中，攪拌均勻后倒入溶液B中，得到溶液C。將0.46 g CaCl2溶于10 mL去離子水后，再加入溶液C作為交聯(lián)劑，攪拌均勻后靜置一定時間，得到溶液E。稱取40 g靜置后的溶液E倒入直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，冷凍干燥32 h即得復(fù)合襯墊。

1.3.2 鮮肉的包裝

將新鮮豬后腿肉打碎成肉末后，每份稱取30 g肉末，分別置于無襯墊、有CMC-Na/CS/MMT襯墊和不同Nisin含量的CMC-Na/CS/MMT/Nisin襯墊（對應(yīng)豬肉中Nisin添加量分別為0.1、0.3、0.5 g/kg）的塑料托盤中，封上保鮮膜，依次標(biāo)記為CK、A、B、C、D，于4 ℃下貯藏。

1.3.3 菌落總數(shù)的測定

參考Liu Qian等[15]的方法測定菌落總數(shù)。稱取10 g碎肉于無菌燒杯中，向其中加入90 mL 8.5 g/L的無菌生理鹽水，均質(zhì)1 min。然后用無菌生理鹽水進(jìn)行以10為倍數(shù)的系列稀釋，取3 個稀釋度的樣品勻液各1 mL到無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用平板計(jì)數(shù)瓊脂在（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h。

1.3.4 TVB-N含量的測定

參考GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[16]的半微量定氮法測定TVB-N含量。稱取10 g碎肉于燒杯中，加入100 mL蒸餾水，攪勻，并于25 ℃恒溫振蕩30 min后過濾。取5 mL濾液和5 mL10 g/L MgO混懸液進(jìn)行蒸餾，用蒸餾水作試劑空白。蒸出物質(zhì)用10 mL含甲基紅（2 g/L）和次甲基藍(lán)（1 g/L）的硼酸吸收液（20 g/L）吸收，然后用0.01 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸進(jìn)行滴定。TVB-N含量按公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

式中：V1為液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；V2為試劑空白組消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積/mL；c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度/（mol/L）；14為與1.00 mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量（mg）；m為試樣質(zhì)量/g。

1.3.5 TBARS值的測定

參考Lan Yang等[17]的方法測定TBARS值。稱取碎肉10 g于100 mL離心管中，加入25 mL、體積分?jǐn)?shù)20% TCA和20 mL蒸餾水，10 000 r/min高速勻漿30 s，于4 ℃、5 500 r/min離心15 min，取上清液并過濾。于25 mL比色管中各加入2 mL上述濾液和0.02 mol/L TBA溶液，沸水浴加熱20 min，同時做空白對照（2 mL、體積分?jǐn)?shù)50% TCA＋2 mL 0.02 mol/L TBA，冷卻至室溫，在532 nm波長處測定混合液的吸光度，每個樣品重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。以每千克樣品中所含丙二醛的質(zhì)量來表示TBARS值，具體計(jì)算見公式（2）。

式中：A532nm為實(shí)驗(yàn)組溶液在532 nm波長處測定的吸光度。

1.3.6 pH值的測定

稱取10 g碎肉，加入100 mL去離子水，6 000 r/min勻漿1 min，然后用校正后的pH計(jì)測定混合液的pH值，待穩(wěn)定后讀數(shù)。重復(fù)測定3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.7 蒸煮損失率的測定

參考H o n i k e l[18]的方法測定蒸煮損失率。切取5 cm×5 cm×2 cm大小的肉塊，擦去肉樣的表面水分后稱質(zhì)量并裝入高溫蒸煮袋中，扎緊袋口，然后放入70 ℃的水浴鍋內(nèi)恒溫30 min。取出肉樣后立即用流水冷卻至室溫，擦去表面水分后稱質(zhì)量。蒸煮損失率的計(jì)算見式（3）。

1.3.8 硬度的測定

參考Martinez等[19]的方法采用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測定。切取4 cm×4 cm×2 cm大小的肉塊，在70 ℃水浴鍋內(nèi)加熱30 min，取出肉樣后立即用流水冷卻至室溫。使用直徑為5 mm的圓柱形探頭沿著垂直于肌纖維方向測定。每個樣品選取3 個不同位置進(jìn)行測定，重復(fù)測定3 個樣品，結(jié)果取平均值。測試條件如下：TPA模式，50%形變，測前和測后速率均為1 mm/s，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載為5 g，循環(huán)次數(shù)為2，夾具為TA-BT-KIT。

1.3.9 色度的測定

利用色差儀測定豬肉樣品的亮度L*值、紅綠度a*值和黃藍(lán)度b*值。光源為D65，觀察角為10°，測定直徑為10 mm。使用色差儀前，用配套光阱和白板進(jìn)行校正。擦干肉樣表面水分，并將其置于色差屏的圓孔上進(jìn)行樣品測定。每個樣品選取3 個不同位置進(jìn)行測定，重復(fù)測定3 個樣品，結(jié)果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析（ANOVA），P＜0.05表示差異顯著；利用Origin 2016軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 襯墊中Nisin添加量對鮮肉貯藏過程中菌落總數(shù)的影響

圖1 復(fù)合襯墊中Nisin的添加量對鮮肉貯藏過程中菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effect of nisin content in composite pads on TVC of fresh meat during storage

各組鮮肉在貯藏期間的菌落總數(shù)變化如圖1所示。由于豬肉在屠宰、分割及運(yùn)輸過程中，易受到細(xì)菌污染[20]，初始菌落總數(shù)為5.25（lg（CFU/g））。在4 ℃下貯藏3 d后，CK組的菌落總數(shù)就已超過GB/T 9959.2—2008《分割鮮凍豬瘦肉》[21]對鮮凍豬瘦肉菌落總數(shù)的要求（不高于6.0（lg（CFU/g）））。而有襯墊組的菌落總數(shù)則顯著低于CK組（P＜0.05），A、B和C組的菌落總數(shù)均在第4天超標(biāo)。但D組菌落總數(shù)的增長率一直保持在較低的水平，至貯藏的第5天，D組菌落總數(shù)仍低于6.0（lg（CFU/g））；因此，復(fù)合襯墊中添加Nisin可有效抑制鮮肉中微生物的生長。有研究表明，Nisin的抗菌機(jī)理在于它可與細(xì)菌的細(xì)胞膜相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜變形和破裂，并干擾細(xì)胞壁的生物合成[22]，因此其抗菌效果與劑量相關(guān)。然而，Nisin抗菌譜較窄，僅對革蘭氏陽性菌有效，對豬肉中生長的革蘭氏陰性菌如假單胞菌（Pseudomonas）[23]等則無明顯作用；但襯墊中的CS對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有良好的生長抑制作用[24]。因此，復(fù)合襯墊的抗菌功能可以通過兩種方式實(shí)現(xiàn)，即襯墊基材中的CS與鮮肉直接接觸，以及襯墊吸收肉類汁液發(fā)生溶脹時，釋放出Nisin至鮮肉表面。二者的聯(lián)合使用擴(kuò)大了襯墊的抗菌譜[25]，顯著降低了鮮肉中細(xì)菌的生長速率。

2.2 襯墊中Nisin添加量對鮮肉貯藏過程中TVB-N含量的影響

圖2 復(fù)合襯墊中Nisin的添加量對鮮肉貯藏過程中TVB-N含量的影響Fig.2 Effect of nisin content in composite pads on TVB-N content of fresh meat during storage

鮮肉中TVB-N含量是判定其新鮮度的重要指標(biāo)。如圖2所示，在貯藏第3天，CK組的TVB-N含量就達(dá)到15.87 mg/100 g，已經(jīng)超過了GB/T 9959.2—2008《分割鮮凍豬瘦肉》[22]中規(guī)定的鮮豬肉TVB-N含量標(biāo)準(zhǔn)（15 mg/100 g）。因此，CK組的貨架期僅為2 d，與菌落總數(shù)結(jié)果相一致。貯藏時間相同時，采用復(fù)合襯墊包裝的各組鮮肉的TVB-N含量顯著低于CK組（P＜0.05）。按照此標(biāo)準(zhǔn)，A、B和C組的貨架期延長至3 d，而D組則延長至4 d。TVB-N含量與肉中氨、二甲胺、三甲胺等含量有關(guān)[26]。當(dāng)細(xì)菌大量繁殖，部分微生物產(chǎn)生胞外蛋白酶，使得肌肉蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)含氮化合物發(fā)生分解，就會產(chǎn)生這類物質(zhì)，從而導(dǎo)致TVB-N含量增加[27]。因此，使用具有抑菌效果的復(fù)合襯墊，可顯著抑制鮮肉中TVB-N含量上升。

2.3 襯墊中Nisin添加量對鮮肉貯藏過程中TBARS值的影響

TBARS值是指示肉類脂質(zhì)氧化程度的重要指標(biāo)之一[28]。如圖3所示，復(fù)合襯墊的應(yīng)用有效地降低了鮮肉中TBARS值的增長速率，即延緩了鮮肉中脂質(zhì)的氧化進(jìn)程。貯藏時間相同時，CK組TBARS值均顯著高于采用復(fù)合襯墊包裝的各組（P＜0.05），在貯藏2 d后，D組TBARS值就顯著低于其余3 個襯墊包裝組（P＜0.05）。有研究表明，CS對羥自由基具有一定的清除能力，且作用與其分子中的羥基和氨基有關(guān)[29]。而從圖3還可看出，TBARS值的增長速率與豬肉中的Nisin添加量呈負(fù)相關(guān)。由此說明，Nisin可能也參與了抗氧化過程。盡管Nisin的抗氧化活性并沒有被廣泛報(bào)道，但Fan Lihong等[30]發(fā)現(xiàn)，Nisin接枝的氨乙基羥丙基甲基纖維素的自由基清除活性隨著Nisin接枝程度的增加而提高。因此，在本研究中，Nisin可能與CS共同作用產(chǎn)生抗氧化活性，但其機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

圖3 復(fù)合襯墊中Nisin的添加量對鮮肉貯藏過程中TBARS值的影響Fig.3 Effect of nisin content in composite pads on TBARS value of fresh meat during storage

2.4 襯墊中Nisin添加量對鮮肉貯藏過程中pH值的影響

圖1 復(fù)合襯墊中Nisin的添加量對鮮肉貯藏過程中pH值的影響Fig.1 Effect of nisin content in composite pads on pH of fresh meat during storage

各組鮮肉的pH值變化如圖4所示。由于微生物繁殖過程中產(chǎn)生的堿性物質(zhì)不斷積累[31]，CK組的pH值在貯藏2 d后均顯著高于采用復(fù)合襯墊包裝的各組（P＜0.05）。A、B和C組的pH值在前3 d都有所下降，這可能是由于肌糖原的無氧酵解產(chǎn)生了乳酸[32]以及三磷酸腺苷分解后產(chǎn)生了無機(jī)磷酸[33]。D組在整個貯藏過程中呈現(xiàn)出相對穩(wěn)定的pH值。這些變化進(jìn)一步證實(shí)了復(fù)合襯墊的使用有效抑制了鮮肉中微生物的生長。

2.5 襯墊中Nisin添加量對鮮肉貯藏過程中蒸煮損失率的影響

由圖5所示，隨貯藏時間的延長，CK組的蒸煮損失率迅速增加。而復(fù)合襯墊的應(yīng)用，尤其是添加了0.5g/kg Nisin的襯墊，對降低鮮肉的蒸煮損失率有顯著效果，貯藏時間相同時，D組蒸煮損失率均顯著低于其余各組（P＜0.05）。在貯藏第3天，D組的蒸煮損失率僅為CK組的56.84%；這表明Nisin的添加可有效降低鮮肉的蒸煮損失率。蒸煮損失率與鮮肉的持水能力有關(guān)，而肌肉細(xì)胞胞間結(jié)構(gòu)的破壞和蛋白質(zhì)的降解會導(dǎo)致其持水能力降低[34]。因此，A、B、C和D組的蒸煮損失率均低于CK組，且隨Nisin添加量的增加而降低。

圖5 復(fù)合襯墊中Nisin的添加量對鮮肉貯藏過程中蒸煮損失率的影響Fig.5 Effect of nisin content in composite pads on cooking loss of fresh meat during storage

2.6 襯墊中Nisin添加量對鮮肉貯藏過程中硬度的影響

圖6 復(fù)合襯墊中Nisin的添加量對鮮肉貯藏過程中硬度的影響Fig.6 Effect of nisin content in composite pads on hardness of fresh meat during storage

從圖6可看出，各組鮮肉的硬度隨貯藏時間的延長而降低，但D組的下降速率最慢，且在同一貯藏時間，D組硬度均顯著高于其余各組（P＜0.05）。鮮肉硬度下降主要是由于結(jié)締組織和肌纖維在酶的作用下發(fā)生降解[17]；而Nisin作為一種多肽，自身可水解消耗部分蛋白酶，從而減少肌肉中蛋白質(zhì)的降解，以此保持鮮肉的硬度[35]。

2.7 襯墊中Nisin添加量對鮮肉貯藏過程中色度的影響

鮮肉的顏色是影響消費(fèi)者購買意愿的直接因素。由表1可看出，所有樣品的L*、a*值均隨時間的延長而顯著降低，表明隨貯藏時間的延長，鮮肉的亮度降低。相比之下，復(fù)合襯墊的應(yīng)用有效地降低了L*和a*值的降低速率，其中D組降低最明顯。在貯藏前3 d，CK組的b*值顯著升高（P＜0.05），C、D組則升高不顯著（P＞0.05）。鮮肉的顏色變化主要是由氧合肌紅蛋白被氧化成褐色的高鐵肌紅蛋白導(dǎo)致的，而氧合肌紅蛋白的氧化主要由細(xì)菌污染[36]及脂肪氧化[37]所引起。因此，使用具有抗菌和抗氧化作用的復(fù)合襯墊，能有效抑制鮮肉中氧合肌紅蛋白的氧化，從而延緩鮮肉顏色的變化，提高其感官品質(zhì)。

表1 復(fù)合襯墊中Nisin添加量對鮮肉貯藏過程中L*，a*和b*值的影響Table1 Effect of nisin content in composite pads on color parameters（L*, a* and b*） of fresh meat during storage

3 結(jié) 論

本研究通過在CMC-Na/CS/MMT吸濕襯墊中添加不同量的Nisin，制備出一種抗菌復(fù)合襯墊，將該襯墊用于鮮肉的保鮮包裝實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，該襯墊可有效抑制鮮肉中細(xì)菌的生長，并可降低鮮肉的TVB-N含量、TBARS值和pH值，減少蒸煮損失率，較好地維持鮮肉的硬度和色澤。Nisin和CS的共同作用進(jìn)一步提高了復(fù)合襯墊的抗菌性能，并使其具有一定的抗氧化效果。當(dāng)襯墊中Nisin添加量相當(dāng)于在鮮肉中的添加量0.5 g/kg時，采用此襯墊包裝的鮮肉在4 ℃下的保質(zhì)期相較于不加襯墊時延長了1 倍。此復(fù)合襯墊具有良好的生物可降解性和生物相容性，且因其良好的吸濕性能，可用于保存具有高含水量的易腐食品，如鮮肉、鮮切水果及蔬菜等。