梅花果實品質(zhì)及抑菌、抗氧化活性分析

劉玉霞，楊佳鑫，徐興龍，李慶衛(wèi)*

（花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室，國家花卉工程技術研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，教育部林木花卉育種實驗室，北京林業(yè)大學園林學院，北京 100083）

梅花（Prunus mume）屬薔薇科李屬，是中國的傳統(tǒng)名花，在我國有7 000多年的應用歷史[1-2]和3 000多年的栽培歷史[3]。梅按照用途可以分為觀賞綠化用的花梅和加工食用的果梅，通常所說的梅花是指用來觀賞的花梅。梅由最初以食用梅果為目的的引種栽培，經(jīng)過長期的自然進化和人工定向選擇培育，逐步發(fā)展到今天以觀賞為目的花梅，最后演化為花果兼用梅[4]。陳俊愉曾明確提出：花果兼用梅是梅育種的重要領域，是梅花品種改良的五大目標之一[4]。隨著觀光農(nóng)業(yè)、復合農(nóng)業(yè)等的發(fā)展，花果兼用梅具有良好的應用前景。從果梅中篩選花期早、花型大、重瓣、花色艷麗的品種，或從花梅中篩選豐產(chǎn)、果大、質(zhì)優(yōu)的品種，是選育花果兼用梅的重要方式。

研究表明，梅果實具有抑菌[5-7]、抗氧化[8-11]、抗骨質(zhì)疏松[9]、抗癌[12]、美白皮膚[13]等作用。目前，對梅果實的基本品質(zhì)及功能研究主要集中在青梅和果梅上[6,14]，對花梅（即梅花）果實品質(zhì)性狀少有研究。隨著抗寒梅花育種成功，梅花逐漸應用在北方園林中，而果梅栽培長期以來一直處于南方地區(qū)[4]，在北方地區(qū)的應用較少，因此選育能在北方地區(qū)推廣的抗寒花果兼用梅具有一定意義。本研究通過測定北京地區(qū)栽培的8 個梅花品種（取樣時選取有一定抗寒性、花朵觀賞性強、果實產(chǎn)量較高的品種）果實的品質(zhì)性狀、抑菌和抗氧化活性，對酚類化合物進行分離和檢測，利用生物統(tǒng)計學方法進行差異比較和相關性分析，對觀賞類抗寒梅花的果實品質(zhì)進行評價，以期為抗寒花果兼用梅的選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘美人梅’、‘豐后’、‘武藏野’、‘江北朱砂’、‘鷲峰豐后’、‘淡豐后’、‘粉靨豐后’、‘飛綠萼’8 個品種梅花的果實（8～9 成熟）于2016年7月取自北京林業(yè)大學鷲峰實驗林場（北緯40°3′，東經(jīng)116°5′）。

枯草芽孢桿菌（ATCC6633）、副溶血性弧菌（ATCC17802）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）上海魯微科技有限公司；葡萄糖、蘆丁、沒食子酸、水溶性VE（Trolox） 合肥博美生物科技有限責任公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

PB-10型pH計 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HY211212型手持折光儀 北京云華科儀科技有限公司；NF555便攜式分光色差儀 日本電色工業(yè)株式會社；BIOMATE 3S紫外分光光度計 北京博宇寶威實驗設備公司；高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）儀美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 外觀品質(zhì)指標測定

隨機選取5 枚鮮果，用電子天平稱質(zhì)量，取其平均值，重復4 次。將鮮果去掉果肉，用電子天平稱果核的質(zhì)量，取其平均值，重復4 次。亮度（L*）、紅綠度（a*）、黃藍度（b*）采用色差儀測定?？墒陈拾词剑?）計算。

用游標卡尺測定果實縱徑和橫徑，果形指數(shù)按式（2）計算。

1.3.2 食用品質(zhì)指標測定

總酸質(zhì)量分數(shù)（以檸檬酸計）、pH值的測定采用pH計的電位滴定法[15]；可溶性糖質(zhì)量分數(shù)的測定采用蒽酮比色法[15]；水分質(zhì)量分數(shù)的測定采用直接干燥法[15]；VC含量的測定采用2,4-二硝基苯肼法[15]；可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)的測定采用折光儀法[15]；總酚含量的測定采用福林-酚法[7]；總黃酮含量的測定采用亞硝酸鹽-氯化鋁法[16]。糖酸比按式（3）計算。

1.3.3 HPLC-MS鑒定酚類化合物成分

HPLC條件[17]：流動相A：甲醇；流動相B：0.1%甲酸溶液；體積比40∶60；流速：0.55 mL/min。MS條件：電噴霧（electron spray ionization，ESI）離子源；正離子和負離子模式檢測；鞘氣（N2）流速：250 L/h；輔助氣（N2）流速：50 L/h；電壓：3.0 kV；毛細管溫度：350 ℃；毛細管電壓：30 V。

1.3.4 抑菌活性測定

1.3.4.1 梅花果實純汁制備

將梅花果實去皮、去核，切碎、研磨，用4 層紗布擠出濾液，4 000 r/min離心10 min，取上清液。

1.3.4.2 菌懸浮液制備

利用平板劃線法將菌株接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，在37 ℃下培養(yǎng)24 h。挑取單個菌落于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基內(nèi)，在37 ℃下?lián)u動培養(yǎng)至所需濃度。無菌操作下將細菌濃度調(diào)至0.5麥氏比濁單位，用于后續(xù)實驗。

1.3.4.3 濾紙片擴散法測定抑菌圈直徑

將20 mL熔融的水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基倒入直徑90 mm培養(yǎng)皿中，凝固后取200 μL菌液均勻涂布在培養(yǎng)基表面，待培養(yǎng)基風干，等距離放入直徑6 mm無菌濾紙片。用微量移液器吸取10 μL浸提液至濾紙片上。37 ℃培養(yǎng)18 h，每個樣品重復3 次，十字交叉法測定抑菌圈直徑。

1.3.5 抗氧化活性的測定

1.3.5.1 樣品制備

各樣品分別稱取3.00 g左右，以料液比1∶10加入90%乙醇溶液，于90 ℃水浴中加熱2 h，4 000 r/min離心10 min，濾紙過濾后濾液裝入棕色瓶中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.2 DPPH自由基清除能力的測定

參考Mezadri等[18]的方法稍做調(diào)整。準確稱取5 mg 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）溶解于100 mL無水乙醇中，置于棕色瓶中，在4 ℃避光保存，制成DPPH工作液。吸取待測樣品0.5 mL，加入2.5 mL DPPH工作液，漩渦振蕩混勻，避光37 ℃水浴30 min，在517 nm波長處測吸光度。以Trolox作為對照。按照公式（4）計算DPPH自由基清除率。

式中：Ai為加入0.5 mL樣品溶液和2.5 mL DPPH工作液的吸光度；Aj為加入0.5 mL樣品溶液和2.5 mL無水乙醇的吸光度；A0為加入0.5 mL乙醇和2.5 mL DPPH工作液的吸光度。

1.3.5.3 總抗氧化能力的測定

方法參考Rvanden等[19]的方法稍做調(diào)整，采用2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基清除實驗測定樣品的總抗氧化能力。ABTS工作液配制：10 mL 0.22 mmo1/L ABTS溶液和10 mL 0.2623 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，避光過夜。使用時用pH 7.4磷酸鹽緩沖液稀釋40 倍。取20 μL樣液加入體積分數(shù)90%乙醇溶液定容至100 μL，加入2.5 mL ABTS工作液，漩渦振蕩混勻，避光37 ℃水浴30 min，在746 nm波長處測吸光度。以Trolox作為對照。按照公式（5）計算ABTS＋·清除率。

式中：Ai為加入0.1 mL樣品溶液和2.5 mL ABTS工作液的吸光度；Aj為加入0.1 mL樣品溶液和2.5 mL磷酸鹽緩沖液的吸光度；A0為加入0.5 mL乙醇溶液和2.5 mL ABTS工作液的吸光度。

1.3.5.4 亞硝酸鹽清除能力的測定

參考薛長暉等[20]的方法稍作調(diào)整。取2 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中，加入0.005 mg/mL亞硝酸鈉標準溶液3 mL和pH 3.0磷酸-檸檬酸緩沖液5 mL，37 ℃下反應30 min，立即加入2 mL質(zhì)量分數(shù)0.4%對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后加入1 mL質(zhì)量分數(shù)0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加蒸餾水定容至刻度，混勻，靜置15 min，在544 nm波長處測定吸光度。以Trolox作為對照。按照公式（6）計算亞硝酸鹽清除率。

式中：Ai為加入2 mL樣品溶液時反應溶液的吸光度；Aj為僅加入2 mL樣品溶液不加反應液時的吸光度；A0為不加樣品溶液時反應液的吸光度。

1.3.5.5 還原能力的測定

還原能力的測定采用鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法，參考B e n z i e等[21]的方法稍作調(diào)整。F R A P工作液由0.3 m o l/L醋酸鹽緩沖液25 m L、10 mmol/L三吡啶基三嗪溶液2.5 mL和20 mmol/L FeCl3溶液2.5 mL組成。取0.5 mL待測樣品溶液，加入2.5 mL FRAP工作液混勻后37 ℃反應30 min，在593 nm波長處測定吸光度。以Trolox作為對照，利用標準曲線法計算還原能力。

鐵還原能力的測定參考Venkatachalam等[22]的方法稍作調(diào)整。0.1 mL樣品溶液中分別加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液0.5 mL、質(zhì)量分數(shù)1%鐵氰化鉀溶液0.5 mL混合均勻，50 ℃水浴下保溫20 min，再加入質(zhì)量分數(shù)10%三氯乙酸溶液0.5 mL，振蕩混勻后離心。取離心后的上清液0.8 mL，加入0.8 mL去離子水和0.16 mL質(zhì)量分數(shù)0.1%氯化鐵溶液，振蕩混勻后在50 ℃水浴下保溫10 min，在700 nm波長處測定吸光度。以Trolox作為對照，利用標準曲線法計算鐵還原能力。

1.3.5.6 梅花果實等級評價

根據(jù)房經(jīng)貴等[14]對果梅的分類標準，從鮮果質(zhì)量、可食率、可溶性固形物、總酸量、果核質(zhì)量5 個方面對8 個品種梅花果實進行等級評價。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2013軟件建立數(shù)據(jù)庫，用SPSS 13.0軟件進行相關性分析和方差分析及最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種梅花果實外觀品質(zhì)指標分析

不同的梅加工制品對果實大小有著不同的要求[14]，由表1可知，‘武藏野’、‘粉靨豐后’鮮果質(zhì)量顯著高于其他品種，分別為33.76 g和33.58 g；‘飛綠萼’鮮果質(zhì)量最小，為6.50 g。各果實可食率范圍在87.18%～94.59%之間，其中‘美人梅’可食率最高，‘飛綠萼’最低?？墒陈蕸Q定了梅果實的加工利用率，因此是影響梅加工品質(zhì)量的重要因子之一，一般要求果實的可食率在85%以上，且越高越好[14]。從果形指數(shù)來看，多個品種之間果形指數(shù)差異不明顯，整體范圍在0.94～1.04之間。L*值代表明暗度，‘淡豐后’和‘飛綠萼’L*值較高，‘美人梅’L*值最低。a*值代表紅綠度，‘美人梅’、‘鷲峰豐后’、‘粉靨豐后’、‘淡豐后’a*值為正，顏色偏紅或者有部分紅色，‘美人梅’a*值顯著大于其他品種；b*值代表黃藍度，8 個品種的b*值均為正，顏色都偏黃或有部分黃色，‘飛綠萼’、‘鷲峰豐后’、‘淡豐后’b*值顯著大于其他品種。

表1 不同品種梅花果實外觀品質(zhì)指標Table1 Appearance and quality characteristics of fruits of Prunus mume

2.2 不同品種梅花果實食用品質(zhì)指標分析

如表2所示，不同品種梅花果實水分質(zhì)量分數(shù)在84.88%～91.89%之間，其中‘江北朱砂’水分質(zhì)量分數(shù)顯著高于其他品種?？扇苄怨绦挝镔|(zhì)量分數(shù)在5.93%～12.62%之間，其中‘美人梅’顯著高于其他品種，‘豐后’、‘江北朱砂’顯著低于其他品種。可溶性糖質(zhì)量分數(shù)在1.96%～5.73%之間，‘粉靨豐后’可溶性糖質(zhì)量分數(shù)最高，‘江北朱砂’最低?？偹豳|(zhì)量分數(shù)在2.49%～8.62%之間，‘飛綠萼’總酸質(zhì)量分數(shù)最高，‘粉靨豐后’最低。糖酸比范圍在0.32～2.30之間。梅果實是典型的低糖高酸型果實，但本研究中‘美人梅’、‘粉靨豐后’可溶性糖質(zhì)量分數(shù)高于總酸質(zhì)量分數(shù)。pH值范圍在2.83～3.20之間，其中‘粉靨豐后’的pH值最大。VC含量在6.00～48.63 mg/100 g之間，其中‘豐后’、‘飛綠萼’、‘江北朱砂’VC含量顯著大于其他5 個品種。總酚含量在43.50～363.21 mg/100 g之間，總黃酮含量在45.48～285.40 mg/100 g之間，其中‘武藏野’、‘豐后’、‘飛綠萼’總酚和總黃酮含量顯著高于其他品種，其次為‘美人梅’，‘江北朱砂’、‘粉靨豐后’、‘鷲峰豐后’、‘淡豐后’之間無顯著性差異。

2.3 酚類化合物鑒定分析結(jié)果

對總酚含量最高的3 個品種‘豐后’、‘武藏野’、‘飛綠萼’的酚類物質(zhì)進行分析（表3）。從3 個品種中共鑒定出21 種酚類化合物，其中‘豐后’中鑒定出17 種，‘武藏野’中鑒定出16 種，‘飛綠萼’中鑒定出10 種。3 個品種都分離出兒茶素、迷迭香酸、圣草酚、丁香酸和蘆丁5 種化合物，其HPLC圖譜如圖1所示。

表3 HPLC-MS鑒定酚類化合物結(jié)果Table3 Identi fi cation of phenolic compounds by HPLC-MS

表2 不同品種梅花果實食用品質(zhì)指標Table2 Eating quality characteristics of fruits of Prunus mume

圖1 5 種酚類化合物HPLC圖譜Fig.1 HPLC prof i les of5 phenolic compounds

2.4 不同品種梅花果實的抑菌活性分析

表1 不同品種梅花果實對3 種菌株的抑菌活性Table1 Antimicrobial activity against three strains of different cultivars

如表4所示，8 個品種梅花果實純汁對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑在7.17～9.00 mm之間，‘江北朱砂’、‘飛綠萼’、‘豐后’、‘武藏野’果實純汁的抑菌作用顯著大于‘粉靨豐后’；對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在6.00（無抑菌作用）～16.67 mm之間，其中‘飛綠萼’抑菌作用最強，‘粉靨豐后’、‘鷲峰豐后’、‘美人梅’沒有抑菌作用；對副溶血性弧菌的抑菌圈直徑在7.83～17.33 mm之間，其中‘豐后’的抑菌作用最強。

2.5 不同品種梅花果實的抗氧化活性分析

表5 不同品種梅花果實的抗氧化活性Table5 Antioxidant activity of different cultivars

如表5所示，從DPPH自由基清除能力來看，‘飛綠萼’、‘武藏野’、‘豐后’、‘江北朱砂’顯著高于其他4 個品種。從還原能力（FRAP）來看，‘豐后’和‘武藏野’顯著高于其他品種。從亞硝酸鹽清除能力來看，‘豐后’和‘武藏野’最強，其次是‘飛綠萼’，其他5 個品種間無顯著性差異。從鐵還原能力和總抗氧化能力來看，排序前3 位的品種依次為‘武藏野’、‘豐后’、‘飛綠萼’。從5 個抗氧化指標綜合來看，‘武藏野’、‘豐后’、‘飛綠萼’抗氧化活性較強。

2.6 相關性分析

由表6可知，不同品種梅花果實對枯草芽孢桿菌的抑制作用與糖酸比呈極顯著負相關；與總酚、總黃酮含量、總酸質(zhì)量分數(shù)相關性不顯著。不同品種梅花果實對金黃色葡萄球菌的抑制作用與總酸質(zhì)量分數(shù)呈極顯著正相關；與總酚、總黃酮含量、糖酸比相關性不顯著。不同品種梅花果實對副溶血性弧菌的抑制作用與總酚、總黃酮含量呈顯著正相關；與總酸質(zhì)量分數(shù)和糖酸比相關性不顯著。不同品種梅花果實對不同菌株的抑菌活性間相關性不顯著。

表6 不同品種梅花果實食用品質(zhì)指標與抑菌活性的相關性分析Table6 Correlation analysis between antimicrobial activity and quality characteristics in different cultivars

表7 不同品種梅花果實食用品質(zhì)指標與抗氧化能力的相關性分析Table7 Correlation analysis of antioxidant activity and the quality characteristics in different cultivars

如表7所示，DPPH自由基清除能力與總酚、總黃酮、VC含量相關性不顯著。還原能力（FRAP）和總抗氧化能力與總酚含量呈極顯著性正相關，與總黃酮含量呈顯著正相關，與VC含量相關性不顯著。亞硝酸鹽清除能力和鐵還原能力與總酚和總黃酮含量呈極顯著性正相關，與VC含量相關性不顯著。5 個評價指標中，還原能力（FRAP）、亞硝酸鹽清除能力、鐵還原能力、總抗氧化能力之間存在顯著或極顯著正相關，而DPPH自由基清除能力僅與鐵還原能力存在顯著性正相關。

2.7 梅花果實等級評價

從鮮果質(zhì)量來看：‘飛綠萼’、‘鷲峰豐后’為1級；‘豐后’、‘江北朱砂’為2級；‘美人梅’為5級；‘淡豐后’為7級；‘粉靨豐后’、‘武藏野’為9級。從可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)來看：‘豐后’、‘江北朱砂’為3級；‘武藏野’為5級；‘鷲峰豐后’、‘淡豐后’、‘粉靨豐后’、‘飛綠萼’為7級；‘美人梅’為9級。從總酸質(zhì)量分數(shù)來看：‘粉靨豐后’為1級；‘美人梅’、‘鷲峰豐后’為3級；‘武藏野’、‘江北朱砂’為5級；‘豐后’、‘淡豐后’為7級；‘飛綠萼’為8級。從可食率來看：‘豐后’、‘飛綠萼’為5級；其他品種為7級。從果核質(zhì)量來看：‘美人梅’、‘江北朱砂’、‘鷲峰豐后’、‘飛綠萼’為1級；‘豐后’為3級；‘粉靨豐后’為5級；‘武藏野’和‘淡豐后’為7級。

3 討 論

從果梅分類標準來看，‘淡豐后’評價等級最高，5 個指標均為7級；‘粉靨豐后’、‘武藏野’、‘飛綠萼’有3 個指標為7級及以上，故可以從‘淡豐后’、‘粉靨豐后’、‘武藏野’及‘飛綠萼’中選育抗寒花果兼用梅。

除基本品質(zhì)外，總酚、總黃酮等功能性成分含量也是影響果實品質(zhì)評價的重要指標。本研究結(jié)果表明，總酚、總黃酮含量與梅果實抑菌和抗氧化活性均具有相關性，這與Xia Daozong[7]、Pan[8]等的研究結(jié)果一致。本研究中‘豐后’、‘武藏野’、‘飛綠萼’總酚和總黃酮含量最高，從3 個品種中共鑒定出21 種酚類化合物，且都分離出兒茶素、迷迭香酸、圣草酚、丁香酸、蘆丁5 種酚類化合物。研究表明，兒茶素具有抗炎、抗菌、抗病毒及抗氧化等作用[23-24]，迷迭香酸具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用[25-26]，圣草酚可以通過清除自由基而抑制自由基誘導的生物大分子損傷，同時可以顯著抑制肝癌細胞的活性[27]，蘆丁具有抗菌消炎、抗輻射、止血和抗氧化等作用[28-30]，丁香酸具有抗內(nèi)毒素作用[31]。故‘豐后’、‘武藏野’、‘飛綠萼’可以作為天然抗氧化劑或者功能性食品進行開發(fā)利用。綜上，‘武藏野’和‘飛綠萼’果實品質(zhì)性狀較優(yōu)。本研究為梅花果實品質(zhì)評價及抗寒花果兼用梅選育提供依據(jù)，為梅花果實的綜合利用和生產(chǎn)天然抗氧化劑以及功能性食品的開發(fā)提供參考。