采用改良(1,3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)法監(jiān)測(cè)某部中心醫(yī)院侵襲性毛孢子菌感染情況

祝 賀，敖俊紅，楊蓉婭

毛孢子菌廣泛存在于部隊(duì)日常野外訓(xùn)練接觸到的土壤、水源及腐敗植物中，實(shí)際感染率并不低。傳統(tǒng)的診斷方法主要是皮損、血漿、痰、腦脊液或內(nèi)臟組織培養(yǎng)。其中，血培養(yǎng)對(duì)侵襲性真菌感染的診斷尤為常用，但檢出率較低，漏診幾率較高。毛孢子菌感染的篩查在臨床中特別是在重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）、導(dǎo)管室等感染高發(fā)部門還沒有普遍開展。

(1,3)-β-D-葡聚糖（BG）是真菌細(xì)胞壁主要組成成分，只有當(dāng)真菌被吞噬、細(xì)胞壁被破壞后才釋放到血液和其他體液中。臨床上檢測(cè)BG的實(shí)驗(yàn)稱為G試驗(yàn)，主要用于診斷侵襲性念珠菌和曲霉感染，對(duì)真菌感染的排查具有非常重要的價(jià)值[1]。但傳統(tǒng)G試驗(yàn)需要反復(fù)大量采集血液標(biāo)本，不適用于野外作訓(xùn)環(huán)境；且由于技術(shù)條件限制和外界熱源的干擾，誤診和漏診率較高，需要操作技術(shù)的改良和更多標(biāo)本類型的補(bǔ)充替代。本研究旨在運(yùn)用改良后的G試驗(yàn)與分子生物學(xué)方法對(duì)照并結(jié)合，以提高毛孢子菌的臨床檢出率，找到可代替?zhèn)鹘y(tǒng)標(biāo)本的采集法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

收集從2014年10月—2017年10月，北方某部中心醫(yī)院現(xiàn)有ICU病房中來自基層作訓(xùn)部隊(duì)送診的不明原因發(fā)熱和系統(tǒng)衰竭患者和其他來源的ICU或NICU病房?jī)?nèi)所有毛孢子菌易感染人群，如長(zhǎng)期臥床使用呼吸機(jī)、留置導(dǎo)尿管、移植及植入術(shù)后不明原因高熱、急性呼吸窘迫綜合征、慢性支氣管擴(kuò)張并發(fā)感染，小兒難治性肺炎和持續(xù)性發(fā)熱等患者共計(jì)154例，其中軍隊(duì)人員56例，其他人員98例。排除標(biāo)準(zhǔn)：2周內(nèi)進(jìn)行血透者；靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或其他血液制品者；細(xì)菌菌血癥者；使用多糖類抗癌藥物、放化療藥物者；1周內(nèi)食用菌類食物者。所有患者于入院后第1周、第2周時(shí)分別采集血漿1 ml、尿液5 ml；急性呼吸窘迫綜合征、慢性支氣管擴(kuò)張并發(fā)感染、小兒難治性肺炎患者，于入院第1周和2周時(shí)采集支氣管肺泡灌洗液20 ml。訓(xùn)練開放傷后送人員在入院后1周內(nèi)采集傷口分泌物。所有患者均簽署知情同意，并通過倫理委員會(huì)審核。

1.2 試劑與儀器

GlucatellTM試劑盒（美國(guó)CAPE公司），MK3自動(dòng)酶聯(lián)測(cè)定儀（美國(guó)Thermo公司）。DNA提取用Fast DNA?SPIN試劑盒（MP Bio公司）。PCR擴(kuò)增用TaKaRa Taq?聚合酶、dNTP、限制性核酸內(nèi)切酶及100 bp Ladder均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。API 21AUX生化鑒定試劑盒（法國(guó)梅里埃公司）。外置游離加熱器（裝置由西安交通大學(xué)機(jī)械學(xué)院研制）。全部玻璃器皿及不銹鋼鑷子經(jīng)235℃干烤7 h去除熱原；塑料制品經(jīng)3%雙氧水浸泡4 h后37℃干燥。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察與菌種鑒定

將所有標(biāo)本分別點(diǎn)種于沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基（SDA，葡萄糖濃度為4%，不加放線菌酮），22℃培養(yǎng)10 d。10 d后有淡黃色、表面腦回樣皺褶的干酪樣菌落生長(zhǎng)，玻片小培養(yǎng)鏡下可見矩形關(guān)節(jié)孢子，API 21AUX生化鑒定為毛孢子菌屬者為陽性，不能同時(shí)滿足上述條件者為陰性。

1.4 BG測(cè)定

各標(biāo)本等量分置于兩組滅熱源的EP管中，分為實(shí)驗(yàn)A組和實(shí)驗(yàn)B組。根據(jù)G試驗(yàn)原理，按GlucatellTM試劑盒操作說明進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)A組：將血液、支氣管肺泡灌洗液、尿液標(biāo)本，分別通過外置游離加熱器均勻預(yù)熱處理（160℃，3 h）后，各取100 μl，放入96孔微孔板中，加入主要反應(yīng)試劑G因子50 μl，于37℃加熱板上孵育30 min。 加入終止反應(yīng)的重氮偶聯(lián)試劑，混勻后在540 nm波長(zhǎng)濾光片下測(cè)定其OD值并自動(dòng)換算BG濃度值，每次均同時(shí)做空白及設(shè)陽性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)B組除不進(jìn)行外置游離加熱器預(yù)處理外，所有實(shí)驗(yàn)步驟與A組相同。精密度試驗(yàn)：將同一標(biāo)本在同一時(shí)間用同批號(hào)試劑重復(fù)測(cè)定25次；將同一份標(biāo)本在不同時(shí)間試驗(yàn)中分別測(cè)定25次。結(jié)果判斷：血漿BG濃度＞20 pg/ml為陽性，否則為陰性。

1.5 巢式聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

血漿、支氣管肺泡灌洗液及尿液各100 μl按試劑盒提示步驟提取DNA。引物設(shè)計(jì)：ITS1:5'-TCCGTAGGTGAAC-3'，ITS4:5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3'。巢式PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體積為50 μl，94℃預(yù)變性 3 min，94℃ 30 s，57℃ 1 min，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min；取1 μl首次擴(kuò)增產(chǎn)物作模板，加入第二對(duì)引物及相關(guān)反應(yīng)試劑，經(jīng)94℃預(yù)變性 3 min，94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。第2次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl在1.2%瓊脂糖凝膠電泳。質(zhì)量控制：每次PCR擴(kuò)增分別設(shè)立陽性及陰性對(duì)照。陽性對(duì)照應(yīng)用β-肌動(dòng)蛋白；陰性對(duì)照用無菌蒸餾水。DNA序列分析：用玻璃奶DNA回收試劑盒對(duì)凝膠中的DNA進(jìn)行回收，并經(jīng)ABI377核苷酸測(cè)序儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 毛孢子菌檢出情況

共檢測(cè)出不同種類毛孢子菌43株。所有菌株ITS區(qū)均可擴(kuò)增出539-540 bp的片段，各菌株的酶切圖譜基本一致。其中支氣管肺泡灌洗液15株，血液10株，尿液3，其余15株均來源于野外訓(xùn)練傷開放性傷口分泌物，由于為皮膚淺表感染，不列入本文G試驗(yàn)與巢式PCR檢測(cè)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2.2 傳統(tǒng)G試驗(yàn)與改良G試驗(yàn)比較

對(duì)比實(shí)驗(yàn)A、B兩組不同檢測(cè)方法的敏感性及特異性，結(jié)果顯示A組與B組相比，敏感性和特異性均有提升，其中敏感性和準(zhǔn)確度的提高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而假陽性和假陰性率均下降（表1）。入院1周后毛孢子菌感染患者的血漿、支氣管肺泡灌洗液和尿液的BG檢測(cè)陽性率較入院2周時(shí)高（P＜ 0.05）（表 2）。

2.3 入院1周毛孢子菌感染患者3種體液標(biāo)本及檢測(cè)方法敏感性與特異性比較

在血漿和支氣管肺泡灌洗液中改良G試驗(yàn)敏感性高于巢式PCR擴(kuò)增，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而巢式PCR的特異性優(yōu)于改良G試驗(yàn)（表3）。

表1 兩組的敏感性與特異性比較

表2 毛孢子菌感染患者不同入院時(shí)間的體液標(biāo)本陽性率比較 （%）

表3 入院1周毛孢子菌感染患者不同標(biāo)本及檢測(cè)方法敏感性與特異性的比較

3 討論

侵襲性真菌感染是增加免疫缺陷患者病死率的重要因素之一，因此早期診斷就顯得尤為重要。傳統(tǒng)的診斷需要對(duì)相關(guān)組織進(jìn)行培養(yǎng)和組織病理學(xué)檢查，而血液培養(yǎng)仍然是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。培養(yǎng)物需要1周以上的生長(zhǎng)期與鑒定期，對(duì)于侵襲性真菌感染患者來說，這種診斷延遲是致命的[2]。

BG水平對(duì)于侵襲性真菌感染具有早期預(yù)警和反應(yīng)感染轉(zhuǎn)歸的重要意義，尤其是在尚未出現(xiàn)感染癥狀時(shí)，對(duì)BG水平進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，可以更好地預(yù)防和控制感染的發(fā)生、發(fā)展[3]。但有研究顯示，傳統(tǒng)G試驗(yàn)在某些患者中存在較高的假陽性率，如革蘭陰性細(xì)菌感染者[4]，這通常是由于標(biāo)本內(nèi)革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素（LTP）的干擾。該成分是革蘭陰性細(xì)菌外膜的組分，一般的高壓滅菌不能使其滅活。因此，筆者在實(shí)驗(yàn)前對(duì)標(biāo)本進(jìn)行了160℃、3 h的改良設(shè)備預(yù)處理，以滅活細(xì)菌內(nèi)毒素這一干擾熱原。由于160℃僅對(duì)BG有解螺旋作用，冷卻后，螺旋結(jié)構(gòu)復(fù)性，不影響G試驗(yàn)數(shù)值的讀取，從而提高了G試驗(yàn)的敏感性和特異性，降低了假陽性率[5]。同時(shí)筆者在人群的篩選上，將腫瘤化療人群進(jìn)行了剔除，主要原因是這部分患者可能具有多種真菌和細(xì)菌在腔道的定植，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[6]。

BG水平雖然可以提示有無真菌的感染，甚至評(píng)價(jià)感染的轉(zhuǎn)歸，但不能確定真菌種類，臨床上往往只能先經(jīng)驗(yàn)性用藥，并等待培養(yǎng)與藥敏結(jié)果。筆者選擇聯(lián)合分子生物學(xué)巢式PCR擴(kuò)增以提高毛孢子菌的檢出率和檢測(cè)特異性。研究發(fā)現(xiàn)毛孢子菌特異性片段巢式PCR擴(kuò)增與BG檢測(cè)在敏感性上相差不大，但由于PCR擴(kuò)增的目標(biāo)是真菌的核酸片斷，需要有完整菌體的支持，因此在含有大量吞噬細(xì)胞的血漿和支氣管肺泡灌洗液中敏感性較改良G試驗(yàn)略低。

兩種檢測(cè)方法均顯示支氣管肺泡灌洗液與血漿有著相似的敏感性和特異性，其中改良G試驗(yàn)在支氣管肺泡灌洗液中的敏感性在入院1周時(shí)更優(yōu)于巢式PCR，且避免了傳統(tǒng)檢測(cè)需要反復(fù)采血的問題。對(duì)于經(jīng)呼吸道感染的毛孢子菌病患者的早期篩查具有良好的應(yīng)用前景。而巢式PCR的高特異性又彌補(bǔ)了G試驗(yàn)做為非特異性試驗(yàn)的不足，二者相結(jié)合，可以提高毛孢子菌感染的檢出率、縮短檢出時(shí)間。本研究中，尿液中雖然也檢測(cè)出BG和特異性DNA片段，但陽性率均較低，且是否與臥床患者的泌尿系真菌的定植相關(guān)，還有待進(jìn)一步分析。研究發(fā)現(xiàn)，改良G試驗(yàn)對(duì)入院1周的標(biāo)本的敏感性較入院2周時(shí)高，分析原因可能與急性感染早期大量吞噬細(xì)胞、吞噬真菌，釋放BG進(jìn)入體液有關(guān)；2周后，經(jīng)過抗真菌藥物的應(yīng)用，總載菌量減少，因而檢出率有所下降，提示改良G試驗(yàn)更適用于感染早期的診斷。