四物湯含藥血清對(duì)多囊卵巢綜合征卵巢顆粒細(xì)胞自噬的影響

中圖分類號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2025）02-0185-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.02.09

摘要 目的 探討四物湯含藥血清對(duì)多囊卵巢綜合征（PCOS）卵巢顆粒細(xì)胞自噬的影響及潛在機(jī)制。方法 取3 月齡雌性SD大鼠，分別以生理鹽水和不同劑量四物湯灌胃，制備空白血清和不同濃度[0.52、1.04、2.08 g/（kg·d）]四物湯含藥血清。篩選四物湯含藥血清干預(yù)濃度后，將人卵巢顆粒細(xì)胞KGN分為對(duì)照組（細(xì)胞不進(jìn)行任何處理）、脫氫表雄酮（DHEA）組（以50 μmol/L 的DHEA處理細(xì)胞48 h）、空白血清組（以50 μmol/L 的DHEA處理細(xì)胞48 h 后，再用10% 空白血清處理72 h）、中濃度四物湯含藥血清組（以50 μmol/L 的DHEA處理細(xì)胞48 h 后，再用10% 中濃度四物湯含藥血清處理72 h），觀察各組細(xì)胞中的自噬體數(shù)量以及通路相關(guān)蛋白[果糖-1，6-二磷酸酶1（FBP1）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化mTOR（p-mTOR）]、自噬相關(guān)蛋白[p62、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3）]和FBP1 mRNA的表達(dá)水平。將（轉(zhuǎn)染）細(xì)胞分為四物湯組（以50 μmol/L 的DHEA處理細(xì)胞48 h 后，再用10% 中濃度四物湯含藥血清處理72 h）、四物湯+si-NC組（以50 μmol/L 的DHEA處理陰性對(duì)照小干擾RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h 后，再用10% 中濃度四物湯含藥血清處理72 h）、四物湯+si-FBP1 組（以50 μmol/L 的DHEA處理FBP1 小干擾RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h 后，再用10% 中濃度四物湯含藥血清處理72 h），考察敲低FBP1 對(duì)四物湯上述作用的影響。結(jié)果 與對(duì)照組比較，DHEA組細(xì)胞的自噬體數(shù)量明顯增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-mTOR/mTOR、FBP1 蛋白及mRNA的表達(dá)水平均顯著升高，p62 蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與DHEA組和空白血清組比較，中濃度四物湯含藥血清組細(xì)胞的自噬體數(shù)量明顯減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著降低，p-mTOR/mTOR和p62 蛋白、FBP1 蛋白及mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。敲低FBP1 后，與四物湯+si-NC組比較，四物湯+si-FBP1 組細(xì)胞的存活率、p62 蛋白的表達(dá)水平、FBP1 蛋白及mRNA 的表達(dá)水平、p-mTOR/mTOR 均顯著降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論 四物湯可通過上調(diào)KGN細(xì)胞中FBP1 蛋白及mRNA的表達(dá)來(lái)促進(jìn)mTOR蛋白的磷酸化，從而抑制其自噬。

關(guān)鍵詞 四物湯；含藥血清；多囊卵巢綜合征；卵巢顆粒細(xì)胞；FBP1/mTOR信號(hào)通路

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育齡期女性最常見的生殖內(nèi)分泌疾病之一，是導(dǎo)致女性無(wú)排卵性不孕的最常見原因，以高胰島素血癥、高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變、月經(jīng)不調(diào)等為主要癥狀[1]。PCOS是高血壓、2 型糖尿病、妊娠期糖尿病、心血管疾病及子宮內(nèi)膜癌等疾病的重要危險(xiǎn)因素[2]。研究指出，卵泡發(fā)育異常是PCOS的主要特征，而卵泡內(nèi)卵巢顆粒細(xì)胞的增殖、分化及自噬在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著十分重要的作用[3]。其中，卵巢顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育不同階段出現(xiàn)的過度自噬均會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，從而導(dǎo)致排卵障礙和性激素合成失調(diào)，最終誘發(fā)PCOS[4]。

四物湯始載于《仙授理傷續(xù)斷秘方》，以熟地黃、當(dāng)歸、川芎、白芍4 味藥材熬制而成，是中醫(yī)補(bǔ)血、養(yǎng)血的經(jīng)典方。四物湯作為“婦科第一方”，可刺激卵泡發(fā)育、減少卵泡閉鎖，在治療PCOS方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)[5]，但其作用機(jī)制尚不明確。本課題組前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初篩發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BP1 是四物湯的潛在靶基因；同時(shí)，全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BP1 是PCOS 易感基因之一[6]。Liu 等[7]研究表明，果糖-1，6-二磷酸酶1（fructose-1，6-bisphosphatase 1，F(xiàn)BP1）在以高雄激素培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)異常，提示FBP1 蛋白可能參與了PCOS的發(fā)生發(fā)展過程。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是參與自噬負(fù)向調(diào)控的主要因子[8]。mTOR可通過影響細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體功能、葡萄糖攝取等途徑來(lái)影響卵泡的發(fā)育和成熟，進(jìn)而調(diào)控PCOS 進(jìn)程[9]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BP1 可通過調(diào)控mTOR而抑制前列腺癌細(xì)胞自噬[10]?；诖耍狙芯繌腇BP1/mTOR 信號(hào)通路出發(fā)，初步探討四物湯含藥血清對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞自噬的影響，以期為闡明該方治療PCOS的機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括JY300HC型通用型電泳儀（北京君意華鑫科技有限公司）、MK3 型酶標(biāo)儀和LSC0150型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、FluorChem FC3 型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)ProteinSimple 公司）、MyGo Pro 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（英國(guó)IT-IS 公司）、Axio Observer 3 型倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎配方顆粒[批號(hào)分別為2105012W、2201005C、2104012W、2109027C，規(guī)格分別為每袋裝3 g（相當(dāng)于飲片10 g）、2 g（相當(dāng)于飲片3 g）、1g（相當(dāng)于飲片10 g）、1 g（相當(dāng)于飲片3 g）]，均購(gòu)自河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院；胎牛血清和DMEM/F12 培養(yǎng)基（ 批號(hào)分別為SH30070.01、SH30023.02）均購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA；批號(hào)252805）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；兔微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociatedprotein 1 light chain 3，LC3）、p62、FBP1、mTOR、磷酸化mTOR （phosphorylated mTOR，pmTOR）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號(hào)分別為ab63817、ab109012、ab109732、ab134903、ab109268、ab8245、ab6721）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；RIPA細(xì)胞裂解液和BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)分別為P0013J、P0010）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）-LC3質(zhì)粒、FBP1 小干擾RNA及其陰性對(duì)照小干擾RNA（批號(hào)分別為91822、91889、91890）均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；TurboFect 轉(zhuǎn)染試劑和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)分別為R0531、K1691）均購(gòu)自美國(guó)Thermo FisherScientific公司。

1.3 動(dòng)物

3 月齡SPF 級(jí)雌性SD大鼠40 只，體重（290±50）g，用于含藥血清的制備。大鼠由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（豫）2020-0001。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于溫度（23±1）?C、相對(duì)濕度（50±5）%、每12 h明暗循環(huán)的環(huán)境下，自由攝食、飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)PZ-HNSZYY-2022-070）。

1.4 細(xì)胞

人卵巢顆粒細(xì)胞KGN（批號(hào)CL-0603）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法

2.1 四物湯顆粒藥液制備

按相關(guān)文獻(xiàn)[11]的組方配比制備四物湯顆粒藥液：取熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎配方顆粒，按飲片質(zhì)量15∶10∶10∶6 混合，溶于生理鹽水中，制成相應(yīng)濃度的四物湯顆粒藥液，備用。

2.2 空白血清和含藥血清制備

所有雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)分為空白血清組和低、中、高劑量四物湯含藥血清組，每組10 只。四物湯顆粒成人用量為5 g/d，按成人體重60 kg 換算得日劑量，為0.083 3 g/（kg·d）；再進(jìn)一步換算得大鼠給藥低劑量，為0.52 g/（kg·d）[12]。空白血清組大鼠灌胃等體積生理鹽水，低、中、高劑量四物湯含藥血清組大鼠分別灌胃四物湯顆粒0.52、1.04、2.08 g/（kg·d），每天灌胃2次，持續(xù)3 d。末次灌胃后3 h，各組大鼠經(jīng)腹腔麻醉并于腹主動(dòng)脈取血；血樣于4 ?C下靜置1 h，再以3 000 r/min離心10 min，收集上層血清，過濾；血清于56 ?C 下滅活30 min，即得空白血清和低、中、高濃度四物湯含藥血清，于－20 ?C保存，備用。

2.3 藥物干預(yù)濃度篩選

取KGN 細(xì)胞，接種于含10% 胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，于37 ?C、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，以2×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，并分為對(duì)照組（不進(jìn)行任何處理）、DHEA 組（以50 μmol/L 的DHEA 處理48 h，以構(gòu)建PCOS 細(xì)胞模型[13]）、空白血清組（以50 μmol/L 的DHEA處理48 h 后，再用10% 空白血清處理72 h）和低、中、高濃度四物湯含藥血清組（以50μmol/L 的DHEA 處理48 h 后，分別再用10% 低、中、高濃度四物湯含藥血清處理72 h[14]），并設(shè)置不含細(xì)胞、不含藥物的調(diào)零組，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。每孔加入CCK-8溶液10 μL，反應(yīng)2 h，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度（A）值并按下式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組A值－調(diào)零組A值）/（對(duì)照組A值－調(diào)零組A值）×100%。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果篩選后續(xù)實(shí)驗(yàn)含藥血清的干預(yù)濃度。

2.4 細(xì)胞中自噬體數(shù)量檢測(cè)

取KGN 細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔接種于24 孔板中，于37 ?C、5%CO2條件下孵育24 h，待細(xì)胞融合至70% 時(shí)進(jìn)行GFP-LC3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（將GFP-LC3 質(zhì)粒0.5 μg 與無(wú)血清DMEM/F12 培養(yǎng)基100 μL 混合，隨后加入TurboFect轉(zhuǎn)染試劑2 μL混勻，轉(zhuǎn)染48 h），若熒光顯微鏡下可見細(xì)胞發(fā)出明顯的綠色熒光即為轉(zhuǎn)染成功。取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，分為對(duì)照組、DHEA組、空白血清組、中濃度四物湯含藥血清組（四物湯含藥血清干預(yù)濃度根據(jù)“2.3”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置），各組細(xì)胞均按“2.3”項(xiàng)下方法處理，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。取各組細(xì)胞，用4% 多聚甲醛溶液于室溫下固定20 min，再加入0.02%Triton X-100 試劑于室溫下孵育5 min，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色后，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中的自噬體（GFP-LC3 綠色熒光斑點(diǎn)）并記錄其數(shù)量。

2.5 細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白、mTOR蛋白、FBP1 蛋白及mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot 法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KGN 細(xì)胞，按5×105 個(gè)/孔接種于6 孔板中，按“2.4”項(xiàng)下方法分組、處理。收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，以BCA法測(cè)定蛋白濃度后加熱變性。取變性蛋白30 μg 進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5% 脫脂奶粉于室溫下孵育2 h；洗膜后，加入自噬相關(guān)蛋白一抗（LC3、p62，稀釋比例分別為1∶900、1∶800）、通路相關(guān)蛋白一抗（FBP1、mTOR、p-mTOR，稀釋比例分別為1∶700、1∶700、1∶1 000）、內(nèi)參蛋白一抗（GAPDH，稀釋比例為1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；洗膜后，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶2 000），于37 ℃下孵育1 h；洗膜后，加入發(fā)光試劑，并置于化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)下顯影曝光。使用Image Lab 軟件分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的條帶灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平，再以LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的表達(dá)水平比值（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）表示自噬活性，以p-mTOR 與mTOR 的表達(dá)水平比值（p-mTOR/mTOR）表示mTOR蛋白的磷酸化水平。結(jié)果以對(duì)照組為參照進(jìn)行歸一化處理。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)FBP1 mRNA表達(dá)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KGN細(xì)胞，按5×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，按“2.4”項(xiàng)下方法分組、處理。收集細(xì)胞，經(jīng)Trizol試劑裂解后，提取總RNA，經(jīng)純度、含量檢測(cè)后，將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以此cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系包括cDNA 模板 1 μL，PCR 正/反向引物各0.5 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μL，雙蒸水 8μL，共20 μL。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共循環(huán)40 次。以GAPDH 為內(nèi)參，用2－ΔΔCt法計(jì)算FBP1 mRNA的表達(dá)水平。PCR 引物由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成。FBP1 正向引物序列為5′-CTCTATGGCATTGCTGGTTCTA-3′，反向引物序列為5′-CGTGGCAAAGGATGACTTTAAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為108 bp；GAPDH正向引物序列為5′-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3′，反向引物序列為5′-ATTGGGCTCTTCCACACAGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為166 bp。結(jié)果以對(duì)照組為參照進(jìn)行歸一化處理。

2.6 敲低FBP1 對(duì)四物湯含藥血清作用的影響檢測(cè)

取KGN 細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔接種于24 孔板中，于37 ?C、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合至80% 時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染[取陰性對(duì)照小干擾RNA 和FBP1 小干擾RNA各1 μg，分別與不含血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基（含TurboFect 轉(zhuǎn)染試劑2.5 μL）1 mL 混合，再與KGN 細(xì)胞共同孵育24 h，即得陰性對(duì)照小干擾RNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞和FBP1 小干擾RNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Western blot 檢測(cè)示二者FBP1 蛋白表達(dá)水平分別較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞變化不大或顯著降低，即為轉(zhuǎn)染成功]。將KGN細(xì)胞和轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為四物湯組（以50 μmol/L 的DHEA處理KGN細(xì)胞48 h 后，再用10% 中濃度四物湯含藥血清處理72 h）、四物湯+si-NC 組（以50 μmol/L 的DHEA 處理陰性對(duì)照小干擾RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h 后，再用10% 中濃度四物湯含藥血清處理72 h）、四物湯+si-FBP1 組（以50 μmol/L 的DHEA 處理FBP1 小干擾RNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h 后，再用10% 中濃度四物湯含藥血清處理72 h），每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。取各組細(xì)胞，按“2.3”項(xiàng)下方法檢測(cè)其存活率，按“2.5”項(xiàng)下方法檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-mTOR/mTOR 和p62蛋白、FBP1 蛋白及mRNA的表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni檢測(cè)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 四物湯含藥血清干預(yù)濃度的篩選結(jié)果

與對(duì)照組（100%）比較，DHEA 組細(xì)胞的存活率[（35.4±3.6）%]顯著降低（P＜0.05）。與DHEA 組和空白血清組[（34.8±4.5）%]比較，低、中、高濃度四物湯含藥血清組細(xì)胞的存活率[（52.5±6.7）%、（78.3±7.8）%、（81.6±6.9）%]均顯著升高（P＜0.05）。其中，中濃度四物湯含藥血清組細(xì)胞的存活率與高濃度四物湯含藥血清組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），遂后續(xù)僅使用中濃度四物湯含藥血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2 四物湯含藥血清對(duì)KGN細(xì)胞自噬及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，DHEA組細(xì)胞中自噬體數(shù)量明顯增多，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著升高，p62 蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與DHEA 組和空白血清組比較，中濃度四物湯含藥血清組細(xì)胞中自噬體數(shù)量明顯減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著降低，p62 蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖1、圖2、表1。

3.3 四物湯含藥血清對(duì)KGN 細(xì)胞中通路相關(guān)蛋白、mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，DHEA 組細(xì)胞中p-mTOR/mTOR、FBP1 蛋白及mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。與DHEA組和空白血清組比較，中濃度四物湯含藥血清組細(xì)胞中p-mTOR/mTOR、FBP1 蛋白及mRNA的表達(dá)水平亦顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖3、表2。

3.4 敲低FBP1 對(duì)四物湯含藥血清相關(guān)作用的影響

與四物湯組比較，四物湯+si-NC組細(xì)胞的存活率、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-mTOR/mTOR、p62 蛋白、FBP1 蛋白及mRNA的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與四物湯+si-NC組比較，四物湯+si-FBP1 組細(xì)胞的存活率、p62蛋白的表達(dá)水平、FBP1 蛋白及mRNA 的表達(dá)水平、pmTOR/mTOR 均顯著降低，LC3- Ⅱ/LC3- Ⅰ顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖4、表3。

4 討論

PCOS 患者的主要臨床表現(xiàn)包括卵泡發(fā)育異常、排卵障礙及流產(chǎn)[1]。作為卵泡發(fā)育的標(biāo)志，卵巢顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)分化是原始卵泡啟動(dòng)和生長(zhǎng)的關(guān)鍵，其能通過受體介導(dǎo)途徑調(diào)控生長(zhǎng)期卵泡的發(fā)育及卵泡閉鎖，從而在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[15]。長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用表明，四物湯用于女性月經(jīng)紊亂相關(guān)疾病的療效確切[16]?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，PCOS屬于“不孕”“閉經(jīng)”范疇，主要病機(jī)為痰濕瘀血。該方中，君藥熟地黃可補(bǔ)血滋陰，臣藥當(dāng)歸可補(bǔ)血行血，佐藥川芎可祛瘀止痛，佐藥白芍可養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，契合PCOS上述病機(jī)。本研究使用不同劑量的四物湯灌胃大鼠，制備了3 種不同濃度的四物湯含藥血清，CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各濃度四物湯含藥血清對(duì)KGN細(xì)胞的存活均有促進(jìn)作用。

研究表明，PCOS模型動(dòng)物/患者的卵巢顆粒細(xì)胞自噬會(huì)被異常激活[17]。過度自噬會(huì)引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，影響卵細(xì)胞正常發(fā)育，從而導(dǎo)致排卵障礙和性激素合成失調(diào)[4]。因此，通過改變卵巢顆粒細(xì)胞的自噬水平有望成為PCOS治療的有效途徑之一。根據(jù)研究報(bào)道，四物湯活性成分豆甾醇、β-谷甾醇及山柰酚均可抑制細(xì)胞自噬[18―19]，由此本課題組推測(cè)，該方可能具有調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞自噬水平的作用。本研究結(jié)果顯示，四物湯含藥血清可顯著下調(diào)KGN 細(xì)胞中自噬體數(shù)量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，上調(diào)p62 蛋白的表達(dá)，升高mTOR 蛋白的磷酸化水平，說(shuō)明四物湯含藥血清可抑制KGN細(xì)胞自噬。

學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在高雄激素培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞及源自PCOS患者的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞中，F(xiàn)BP1 蛋白的表達(dá)均明顯升高[20―21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DHEA 處理后，KGN細(xì)胞中FBP1 蛋白及mRNA的表達(dá)水平均顯著升高，與之前報(bào)道一致[7]；經(jīng)四物湯含藥血清處理后，KGN細(xì)胞中FBP1 蛋白及mRNA的表達(dá)水平進(jìn)一步升高；敲低FBP1 后，四物湯含藥血清對(duì)KGN細(xì)胞存活率的促進(jìn)作用和對(duì)自噬的抑制作用均被減弱，說(shuō)明FBP1在PCOS進(jìn)展過程中具有保護(hù)作用，高水平的FBP1 可抑制卵巢顆粒細(xì)胞的自噬。

綜上所述，四物湯含藥血清可通過上調(diào)KGN細(xì)胞中FBP1 蛋白及mRNA的表達(dá)來(lái)促進(jìn)mTOR蛋白的磷酸化，從而抑制其自噬，這可能是四物湯改善PCOS的潛在作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] WALKER K，DECHERNEY A H，SAUNDERS R. Menstrual

dysfunction in PCOS[J]. Clin Obstet Gynecol，2021，

64（1）：119-125.

[ 2 ] XU Y L，QIAO J. Association of insulin resistance and elevated

androgen levels with polycystic ovarian syndrome

（PCOS）：a review of literature[J]. J Healthc Eng，2022，

2022：9240569.

[ 3 ] ZHENG Y X，MA L Z，LIU N，et al. Autophagy and apoptosis

of porcine ovarian granulosa cells during follicular

development[J]. Animals（Basel），2019，9（12）：1111.

[ 4 ] SAMARE-NAJAF M，NEISY A，SAMAREH A，et al.

The constructive and destructive impact of autophagy on

both genders’ reproducibility，a comprehensive review[J].

Autophagy，2023，19（12）：3033-3061.

[ 5 ] ZHOU F R，SONG Y F，LIU X，et al. Si-wu-tang facilitates

ovarian function through improving ovarian microenvironment

and angiogenesis in a mouse model of premature

ovarian failure[J]. J Ethnopharmacol，2021，280：

114431.

[ 6 ] ZHAO S G，TIAN Y，GAO X，et al. Family-based analysis

of eight susceptibility loci in polycystic ovary syndrome[

J]. Sci Rep，2015，5：12619.

[ 7 ] LIU T，ZHAO H，WANG J F，et al. The role of fructose-1，

6-bisphosphatase 1 in abnormal development of ovarian

follicles caused by high testosterone concentration[J]. Mol

Med Rep，2017，16（5）：6489-6498.

[ 8 ] XU Z R，HAN X，OU D M，et al. Targeting PI3K/AKT/

mTOR-mediated autophagy for tumor therapy[J]. Appl

Microbiol Biotechnol，2020，104（2）：575-587.

[ 9 ] 馬樺，齊大河，陳雯玥，等. AMPK及mTOR與多囊卵巢

綜合征的關(guān)系及中藥干預(yù)研究進(jìn)展[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)

刊，2024，42（2）：164-170.

MA H，QI D H，CHEN W Y，et al. Chinese medicine regulates

AMPK or mTOR to treat polycystic ovary syndrome：

a review[J]. Chin Arch Tradit Chin Med，2024，42（2）：

164-170.

[10] LI X R，ZHOU K Q，YIN Z，et al. Knockdown of FBP1

enhances radiosensitivity in prostate cancer cells by activating

autophagy[J]. Neoplasma，2020，67（5）：982-991.

[11] 徐王彥君. 基于UPLC-QTOF MS技術(shù)的四物湯灌胃大

鼠代謝組學(xué)初步研究[D]. 合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2015.

XU W Y J. Preliminary study on metabonomics in rats

after oral administration of Si-wu-tang based on UPLCQTOF

MS[D]. Hefei：Anhui Medical University，2015.

[12] 陳夢(mèng)，石丹寧，張則業(yè)，等. 四物湯在大鼠腦和骨骼肌組

織中發(fā)揮雌激素樣效應(yīng)的機(jī)制研究[J]. 中國(guó)醫(yī)藥，2021，

16（10）：1580-1584.

CHEN M，SHI D N，ZHANG Z Y，et al. Study on mechanism

of Siwu decoction exerting estrogenic effects on rats

brain and skeletal muscle tissues[J]. China Med，2021，16

（10）：1580-1584.

[13] 謝芬芬. 褪黑素對(duì)青春期DHEA暴露致PCOS的保護(hù)機(jī)

制研究[D]. 合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2020.

XIE F F. Protective mechanism of melatonin on PCOS induced

by DHEA exposure in adolescence[D]. Hefei：

Anhui Medical University，2020.

[14] 林陶秀，張文娟，張悅健，等. 最佳中藥含藥血清濃度的

篩選方法研究現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2023，29

（2）：195-202.

LIN T X，ZHANG W J，ZHANG Y J，et al. Screening

methods for optimal serum concentration of Chinese medicine：

a review[J]. Chin J Exp Tradit Med Formulae，2023，

29（2）：195-202.

[15] ZHANG T J，BASANG W D，CHANG W H，et al. Dynamics

of apoptosis-related gene expression during follicular

development in yak[J]. J Anim Physiol Anim Nutr

（Berl），2021，105（6）：1002-1013.

[16] HUANG G C，TSAI Y Z，LEE C J，et al. Elucidation of

the effects of Si-wu tang on menstrual disorder patterns

through activation of aromatase and antioxidation[J]. Evid

Based Complement Alternat Med，2019，2019：4761651.

[17] KUMARIYA S，UBBA V，JHA R K，et al. Autophagy in

ovary and polycystic ovary syndrome：role，dispute and future

perspective[J]. Autophagy，2021，17（10）：2706-2733.

[18] ZHAO H G，ZHANG X，WANG M，et al. Stigmasterol simultaneously

induces apoptosis and protective autophagy

by inhibiting Akt/mTOR pathway in gastric cancer cells

[J]. Front Oncol，2021，11：629008.

[19] KIM M J，SONG Y R，KIM Y E，et al. Kaempferol stimulation

of autophagy regulates the ferroptosis under the oxidative

stress as mediated with AMP-activated protein kinase[

J]. Free Radic Biol Med，2023，208：630-642.

[20] LI D，YOU Y，BI F F，et al. Autophagy is activated in the

ovarian tissue of polycystic ovary syndrome[J]. Reproduction，

2018，155（1）：85-92.

[21] MIN Z Y，GAO Q，ZHEN X M，et al. New insights into

the genic and metabolic characteristics of induced pluripotent

stem cells from polycystic ovary syndrome women[J].

Stem Cell Res Ther，2018，9（1）：210.

（收稿日期：2024-07-23 修回日期：2024-12-25）

（編輯：鄒麗娟）