超高效液相色譜－四極桿－飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)非靶向定性篩查豬肉中79種藥物殘留

劉 佳，王建鳳，高麗娟，王秋水，馮月超，劉 艷，丁 奇，王 穎，邵 鵬

（北京市科學(xué)技術(shù)研究院分析測試研究所（北京市理化分析測試中心），北京 100089）

現(xiàn)代畜牧業(yè)中，獸藥被廣泛用于維持動物健康、預(yù)防感染和治療疾?。?］。然而，用藥不規(guī)范或者非法使用違禁藥物將導(dǎo)致動物源性產(chǎn)品中違禁藥物檢出、獸藥殘留超過國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，產(chǎn)生食品安全風(fēng)險(xiǎn)［1－4］。為了確保食品安全，國際食品法典委員會、歐盟委員會、中國等均規(guī)定了食品中藥物最大殘留限量［5］，如GB 31650－2019［6］《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)－食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定了動物源性食品中磺胺類抗生素、倍氯米松等的最大殘留限量。考慮到養(yǎng)殖者用藥的不確定性和復(fù)雜性，建立一種高通量、快速測定動物源性食品中多藥物殘留的檢測方法刻不容緩。

動物源性食品存在基質(zhì)復(fù)雜、干擾物多等特點(diǎn)，且多藥物分析中藥物極性往往差異較大，單一的前處理技術(shù)難以適用于所有目標(biāo)物。最初用于農(nóng)藥殘留分析的快速樣品前處理技術(shù)——QuEChERS目前已被廣泛用于動物源性食品中多類獸藥的殘留分析［7－9］，然而該方法無法充分回收動物養(yǎng)殖中常用的極性藥物，如四環(huán)素和喹諾酮類［5］。因此，建立一種適用于多組分的前處理技術(shù)十分必要。

目前，液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法被廣泛用于動物源性食品中多藥物的同時(shí)檢測［7，10－13］。該法具有高的靈敏度和選擇性，但存在兩點(diǎn)不足：一是無法分析多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）中未定義的化合物，因此無法獲得關(guān)于未知藥物的信息［14］；另一方面，通過串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行多藥物殘留分析可能非常耗時(shí)，尤其是對數(shù)百種不同化合物的分析［15］。四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF MS）具有數(shù)據(jù)采集速度快、分辨能力高、質(zhì)量精度高、檢測靈敏度高等多重優(yōu)點(diǎn)，能夠同時(shí)分析無限數(shù)量的化合物，實(shí)現(xiàn)非靶向目標(biāo)化合物定性，近年來已發(fā)展成為一種高效的篩查方法，在食品安全分析領(lǐng)域有害物質(zhì)高通量、快速篩查方面得到廣泛應(yīng)用［9，14，16－19］。

本研究以GB 31650－2019［6］、《中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號公告》［20］等中限用、禁用的β-興奮劑、蛋白同化激素、抗生素等79種藥物為研究對象，在優(yōu)化樣品前處理技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用超高效液相色譜－四極桿－飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC－Q－TOF MS）技術(shù)，建立了豬肉中79種藥物的多殘留定性篩查方法。該方法具有通量高、簡便、快速等特點(diǎn)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與樣品

Acquity UPLC超高效液相色譜儀、SYNAPT G2－Si四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、Waters Acquity BEH HSS－C18柱（美國Waters公司）；GR22GⅢ高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）；MS200多管渦旋混勻儀（杭州瑞誠儀器有限公司）；N－EVAPTM112恒溫水浴氮吹儀（美國Organomation Associates公司）；Secura225D－1CN天平（德國Sartorius公司）；Vortex Genius 3旋渦混合器（德國IKA公司）；Milli－Q超純水儀（美國Millipore公司）；FAVEX－NM50獸藥殘留快速柱（500 mg/6 mL，高雄巨研科技股份有限公司）。

79種藥物標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）購自德國Dr.Ehrenstorfer公司和美國A Chemtek公司；乙腈、甲醇、甲酸（色譜純）、甲酸銨（美國Thermo Fisher Scientific有限公司）；叔丁基甲基醚（色譜純，美國Sigma－Aldrich公司）；碳酸鈉（Na2CO3）、乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA－Na2）（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；0.22 μm有機(jī)尼龍濾膜（天津津騰公司）。

所用樣品為市售豬肉鮮肉，購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

根據(jù)各藥物標(biāo)準(zhǔn)品的溶解性，選擇甲醇、乙腈等溶劑配制質(zhì)量濃度100～1 000 μg/mL的各藥品單一標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，-18℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別移取適量單一標(biāo)準(zhǔn)品儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋配制成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用基質(zhì)空白提取液逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品制備

1.2.2 .1樣品提取稱取粉碎均質(zhì)后的樣品2 g（精確至0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，先加入10 mL 0.5%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸－乙腈溶液，充分混勻后以2 500 r/min振蕩提取30 min，10 000 r/min下冷凍離心10 min后將上清液全部移出，再加入10 mL甲醇，以2 500 r/min振蕩提取30 min，10 000 r/min冷凍離心10 min，上清液全部移出。分別準(zhǔn)確移取兩次上清液各5 mL，置于FAVEX－NM50凈化柱中，以每秒1滴流速加壓，收集濾液，于40℃氮吹至近干，用1 mL乙腈（0.1%甲酸）∶5 mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）（13∶87，體積比）定容，渦旋復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)尼龍濾膜過濾，待儀器分析。

1.2.2 .2基質(zhì)空白提取液的制備取不含被測物的豬肉樣品，按照“1.2.2.1”操作處理，得到基質(zhì)空白提取液。

1.2.3 分析方法

(1)城鄉(xiāng)發(fā)展聯(lián)動性不足。長沙市城鄉(xiāng)旅游產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和要素目前尚不完整，與工業(yè)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)以及其他產(chǎn)業(yè)融合不足：縣域內(nèi)旅行社、游客集散中心、旅游咨詢中心等功能發(fā)揮的不夠；餐飲住宿、休閑經(jīng)營規(guī)模有待擴(kuò)大，服務(wù)水平有待提升；缺少規(guī)模化的特色手工藝品、土特產(chǎn)等旅游商品及其加工的銷售場所。同時(shí)由于各鎮(zhèn)村各自為政、爭先恐后地做規(guī)劃、出臺優(yōu)惠辦法來發(fā)展鄉(xiāng)村旅游，統(tǒng)籌開發(fā)不足、景點(diǎn)同質(zhì)化情況日漸增多。

1.2.3 .1色譜條件色譜柱：Waters Acquity BEH HSS－C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流動相A：0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸－乙腈；流動相B：0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸-5 mmol/L甲酸銨溶液。梯度洗脫程序：0～0.5 min，13%A；0.5～10.0 min，13%～50%A；10.0～10.75 min，50%～95%A；10.75～12.25 min，95%A；12.25～12.5 min，95%～13%A；12.5～15.0 min，13%A。柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.4 mL/min。

1.2.3 .2質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；離子源溫度：150℃；電噴霧電壓：3 000 V；脫溶劑氣流速：800 L/h；脫溶劑氣溫度：400℃；錐孔氣流速：50 L/h；錐孔電壓：15 V；掃描時(shí)間：0～15 min；掃描間隔時(shí)間：0.1 s；MSE（全信息串聯(lián)質(zhì)譜）模式檢測，靈敏度模式；質(zhì)量掃描范圍：m/z50～1 200；數(shù)據(jù)采集模式：Continuum模式；碰撞能量范圍：10～60 eV。質(zhì)量校正液為亮氨酸腦啡肽。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

利用Masslynx軟件對前處理后的樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以UNIFI軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，基于實(shí)驗(yàn)室自行建立的包括79種藥物在內(nèi)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫［21］進(jìn)行檢索，以目標(biāo)化合物的一級質(zhì)譜精確分子量、保留時(shí)間、碎片離子等信息進(jìn)行藥物殘留的快速定性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

所測定的79種藥物化學(xué)性質(zhì)相差較大，較難達(dá)到良好分離，尤其是對于分子式相同或結(jié)構(gòu)式相近的化合物，其有相近或相同的碎片離子，且出峰時(shí)間相近易造成譜圖干擾。對于高分辨質(zhì)譜，目標(biāo)物質(zhì)在色譜柱上的分離程度越高，其二級質(zhì)譜的干擾碎片信息越少，更有利于定性結(jié)果的準(zhǔn)確判斷［22］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有機(jī)相為乙腈時(shí)，化合物峰形對稱性好、分離度高、保留較好；當(dāng)在水相和有機(jī)相中加入甲酸時(shí)，可明顯提高β-興奮劑、糖皮質(zhì)激素、蛋白同化激素類化合物在離子源中的離子化效率，增加正離子目標(biāo)物質(zhì)的響應(yīng)值。同時(shí)，甲酸銨溶液對部分目標(biāo)物質(zhì)的色譜峰形具有改善作用。因此，結(jié)合出峰時(shí)間、峰形以及化合物響應(yīng)，選用乙腈（0.1%甲酸）-5 mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）作為流動相，梯度洗脫程序見“1.2.3.1”。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

進(jìn)行非靶向篩查時(shí)要求前處理方法能夠全面地提取樣品中的化合物［23］。因此，以提取物質(zhì)的數(shù)量盡可能多為前提進(jìn)行樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化，對提取溶劑進(jìn)行考察。

2.2.1 提取溶劑優(yōu)化

本研究中化合物的極性范圍非常廣泛，且絕大多數(shù)目標(biāo)化合物在有機(jī)溶劑中的溶解度較大，因此分別采用甲醇、乙腈、叔丁基甲基醚中的一種或多種溶劑對目標(biāo)化合物進(jìn)行提取。已有研究表明［16，24］，提取溶劑的pH值會影響酸堿兩性物質(zhì)的電離，因此，同時(shí)考察了有機(jī)溶液中加入弱酸和弱堿對目標(biāo)物的提取效果。分別研究了①甲醇，②0.5%甲酸－甲醇，③乙腈，④0.5%甲酸－乙腈，⑤甲醇和乙腈等比例混合溶劑（含0.5%甲酸），⑥甲醇、乙腈和0.1%EDTA－Na2等比例混合溶劑（含0.5%甲酸），⑦10%Na2CO3和叔丁基甲基醚（1∶9，體積比）的提取效果。不同提取溶劑下目標(biāo)化合物的提取情況如表1所示，提取液⑥和⑦分別提取出77種和51種目標(biāo)化合物，除四環(huán)素類中的土霉素外，提取液③提取出其它78種目標(biāo)化合物。其余4種提取溶劑均提取出全部79種目標(biāo)化合物，目標(biāo)物提取率達(dá)100%。在這4種提取溶劑中，79種目標(biāo)化合物的提取回收率如圖1所示。由于目標(biāo)化合物性質(zhì)差別較大，其回收率表現(xiàn)出較大差異：對于大環(huán)內(nèi)酯類以及磺胺類抗生素，甲醇表現(xiàn)出明顯優(yōu)于其他3種提取溶劑的提取效果；0.5%甲酸-乙腈對大多數(shù)喹諾酮類抗生素、β-興奮劑、蛋白同化激素、糖皮質(zhì)激素以及孕激素拮抗劑的提取效果優(yōu)于其它3種提取溶劑。綜合考慮79種物質(zhì)的平均回收率和目標(biāo)化合物在不同回收率范圍的個(gè)數(shù)（表2），選擇0.5%甲酸－乙腈和甲醇組合作為提取溶劑，并對兩種溶劑的組合順序進(jìn)行優(yōu)化。

表2 不同提取溶劑下豬肉中79種目標(biāo)化合物在不同回收率范圍的個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of 79 target compounds in pork under different extraction solvents in different recovery ranges

圖1 不同提取溶劑對79種目標(biāo)化合物回收率的影響Fig.1 Effect of different solvents on the recoveries of 79 target compounds

表1 不同提取溶劑對豬肉中79種目標(biāo)化合物的提取情況Table 1 Extraction of 79 target compounds from pork with different extraction solvents

2.2.2 提取溶劑組合優(yōu)化

由于物質(zhì)種類較多，每類化合物中選擇2～3種代表性物質(zhì)，考察①先甲醇后0.5%甲酸－乙腈；②先0.5%甲酸－乙腈后甲醇；③甲醇和0.5%甲酸－乙腈同時(shí)提取對回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。除阿奇霉素、羅紅霉素外，組合②對于選定目標(biāo)化合物的提取效果優(yōu)于其他兩種組合。因此，采用先0.5%甲酸－乙腈后甲醇的組合提取順序。

圖2 部分目標(biāo)化合物在不同組合提取順序下的回收率Fig.2 Recoveries of some target compounds under different solvent combinations

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指目標(biāo)分析物以外的其他組分引起的分析信號增強(qiáng)或抑制現(xiàn)象［25］，通過采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值（SSE）來評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)［26］。SSE值為0.8～1.2時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯［27］；當(dāng)SSE＞1.2時(shí)，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)SSE＜0.8時(shí)，表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)［28］。本實(shí)驗(yàn)分別配制豬肉空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與對應(yīng)濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線考察SSE值，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：86.1%（68/79）的目標(biāo)物質(zhì)SEE在0.8～1.2范圍內(nèi)，6.3%（5/79）的目標(biāo)物質(zhì)SEE＜0.8，存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，7.6%（6/79）的目標(biāo)物質(zhì)存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，通常采用同位素內(nèi)標(biāo)法或基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法［22］進(jìn)行校正。本方法的目標(biāo)物質(zhì)接近百種，使用內(nèi)標(biāo)的成本偏高，不利于方法的推廣，因此，采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正以降低基質(zhì)對測定結(jié)果的影響。

表3 豬肉中79種藥物的信號抑制/增強(qiáng)、線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限Table 3 Signal suppression/enhancements（SSEs），regression equations，linear ranges，correlation coefficients（r2），limits of detection（LODs）and limits of quantitation（LOQs）of 79 drugs in pork

（續(xù)表3）

（續(xù)表3）

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量下限

用空白基質(zhì)提取液配制系列濃度的79種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，79種藥物在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均不低于0.99（表3）。分別以3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比對應(yīng)的濃度確定方法的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）［28］，79種藥物的LOD為0.05～10 μg/kg，LOQ為0.10～20 μg/kg。通過與GB 31650－2019［6］中提及的相關(guān)藥物殘留限量相比，該方法定量下限遠(yuǎn)低于對應(yīng)物質(zhì)限量標(biāo)準(zhǔn)，可以很好地滿足食品中藥物殘留的篩查需求。

2.5 非靶向篩查技術(shù)的應(yīng)用

2.5.1 模擬加標(biāo)樣本分析

選取每類物質(zhì)中的1～3種代表性物質(zhì)共21種（普萘洛爾、群勃龍、勃地酮、諾龍、米非司酮、雄烯二酮、氫化可的松、潑尼松、去氫表雄酮、可的松、倍氯米松、氨苯蝶啶、阿奇霉素、羅紅霉素、伊維菌素、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、甲氧芐啶、磺胺甲噻二唑、氧氟沙星、奧比沙星），采用所建立的方法對加標(biāo)水平為10 μg/kg和20 μg/kg的上述21種物質(zhì)的豬肉樣本進(jìn)行檢測。通過檢索質(zhì)譜信息數(shù)據(jù)庫，采用精確質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間的方式進(jìn)行非靶向定性篩查，在質(zhì)量數(shù)精確度允許偏差為10 ppm，保留時(shí)間偏差為0.2 min，且至少檢測到1種碎片離子的條件下，10 μg/kg加標(biāo)水平的篩查結(jié)果見表4，部分典型藥物的全掃描圖見圖3。由表4可知，10 μg/kg加標(biāo)下，除定量下限高于10 μg/kg的倍氯米松（表3）未篩查出外，其余物質(zhì)全部篩出；20 μg/kg加標(biāo)下21種物質(zhì)可全部篩查出來。

圖3 部分典型藥物的全掃描圖Fig.3 Full-scan chromatograms of some typical drugs

表4 10 μg/kg加標(biāo)水平下樣本的篩查結(jié)果Table 4 Screening results of specimen at 10 μg/kg spiked level

（續(xù)表4）

2.5.2 實(shí)際樣本檢測

采用本方法對市售的6份豬肉樣本進(jìn)行篩查分析，結(jié)果顯示，除1份樣本為陰性外，其余5份樣本均檢出氫化可的松，含量為1.39～13.6 μg/kg。所有陽性樣本中氫化可的松的離子加和模式均為［M+H］+。為了檢驗(yàn)篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用高靈敏度Xevo TQ－S串聯(lián)四極桿質(zhì)譜［8］對陽性樣本進(jìn)行驗(yàn)證，以樣品3為例，Xevo TQ－S串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀的確證色譜圖見圖4。與本方法結(jié)果一致。

圖4 樣品3的Xevo TQ－S串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀色譜圖Fig.4 Xevo TQ－S tandem quadrupole mass spectrometer chromatogram of sample 3

我國GB 31650－2019［6］中規(guī)定，氫化可的松是被允許外用于所有食品動物且不需要制定殘留限量的獸藥。結(jié)果表明6份市售豬肉樣本在所研究的79種藥物范圍內(nèi)是安全的。

3 結(jié)論

本研究基于UPLC－Q－TOF MS，建立了無需標(biāo)準(zhǔn)品即可實(shí)現(xiàn)豬肉中79種藥物殘留的快速定性篩查技術(shù)，并將其應(yīng)用于模擬陽性樣本以及隨機(jī)市售樣本的篩查。結(jié)果表明該方法具有通量高、簡便、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，可用于風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警、日常監(jiān)測及應(yīng)急檢測，為豬肉類食品安全提供了有力的技術(shù)支撐。