漢黃芩素對急性肺損傷小鼠的保護作用

葛金林，余雯文，曾余豐，金晨慈，戴元榮

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325027；2.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是一種由創(chuàng)傷、輸血、感染等多種因素所導(dǎo)致的急性進行性呼吸功能不全或呼吸衰竭癥狀，有較高的發(fā)病率和病死率[1]。由于ALI確切的發(fā)病機制不明，因此臨床上尚缺乏有效的針對ALI的治療方法。目前，有研究證明包括黃芩在內(nèi)的多種中藥在ALI的動物模型中，對肺損傷有治療效果，但其準確藥理成分及涉及的分子機制尚不明確。漢黃芩素（wogonin，WOG）作為黃芩的主要藥理成分之一，已被證明可在結(jié)腸炎及皮膚炎癥等動物模型中通過抑制一氧化氮、前列腺素E2等的產(chǎn)生減輕炎癥反應(yīng)[2-4]。但缺乏足夠的研究證明WOG對ALI的治療效果。因此，本研究利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）在小鼠中誘導(dǎo)ALI模型，并予以WOG治療，觀察小鼠肺部損傷改善程度及相關(guān)炎癥指標變化，以期為WOG治療ALI的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑 C57/BL6（SPF級，雄性，6～8周齡）小鼠，購于上海南方模式生物研究中心，許可證號：SYXK（滬）2017-0012。LPS和WOG購于美國Sigma公司；流式抗體anti-CD11b-APC、anti-Gr-1-FITC和anti-F4/80-FITC購于英國BD公司；TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA試劑盒，購于深圳達科為生物科技有限公司；蛋白印跡相關(guān)抗體購于美國Abcam公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 動物分組及ALI模型建立 隨機將C57/BL6小鼠分為空白對照組（Control組）、LPS誘導(dǎo)的ALI組（LPS組）、WOG治療組（WOG組），每組10只。各組處理方法如下：Control組和LPS組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液50 μL；WOG組腹腔注射WOG 5 mg/kg。LPS組和WOG組腹腔給藥1 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉 （50 mg/kg）麻醉小鼠，經(jīng)鼻腔滴注LPS（1 μg/kg，每只50 μL），構(gòu)建小鼠ALI模型，Control組麻醉鼻腔滴注相同體積0.9%氯化鈉溶液。

1.3 模型構(gòu)建結(jié)果及藥物治療效果評估

1.3.1 肺濕重/干重比（W/D）測定：造模24 h后，每組5只小鼠頸椎脫臼法處死，取全肺組織，用 4 ℃預(yù)冷的PBS洗去肺組織表面的殘血（沖洗2次），在濾紙上吸干水分，稱重，記為肺組織濕重（wet weight，W），然后將其置于80 ℃烘箱中烘烤約48 h 至恒重后稱定干重（dry weight，D），計算肺W/D。 W/D代表肺含水量，可評定肺組織水腫的嚴重程度。

1.3.2 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）收集及細胞因子檢測：造模24 h 后，每組5只小鼠頸椎脫臼法處死，剪開頸部皮膚，分離頸部肌肉，暴露氣管，在氣管遠端剪一小口，插入導(dǎo)管固定。分3次灌洗，每次注射500 μL PBS，停留30 s后抽出，收集BALF，其回收率約為90%。離心BALF，收集上清用于細胞因子檢測，收集底層細胞沉淀用于流式細胞術(shù)對中性粒細胞及巨噬細胞計數(shù)。用PBS洗滌以上收集的細胞并進行分組，分別加入相應(yīng)的流式抗體冰上孵育1 h，所用的流式抗體包括：anti-CD11b-APC、anti-Gr-1-FITC和anti-F4/80-FITC，隨后用PBS離心洗滌細胞3次，并用 300 μL PBS重懸細胞后上機流式檢測。最終CD11b+Gr-1+標記為中性粒細胞，CD11b+F4/80+標記為巨噬細胞。將收集的BALF上清液，參照ELISA試劑盒操作說明書檢測BALF中細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的濃度。

1.3.3 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察及NF-κB信號通路蛋白檢測：“1.3.2”項的5只小鼠打開胸腔，取出肺組織。右肺用4 ℃預(yù)冷的PBS洗去肺組織表面的殘血，然后將其置于多聚甲醛溶液中固定24 h，70%乙醇脫水3次，冰凍切片、HE染色觀察。左肺提取肺組織蛋白，采用BCA法進行定量，SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入目標一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入相應(yīng)HRP標記的二抗室溫孵育2 h，滴加ECL發(fā)光，顯影，使用Image J進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用±s表示，各組間指標差異比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WOG對LPS誘導(dǎo)的小鼠肺W/D的影響 LPS氣管灌注造模24 h后，對其W/D進行測定評估肺水腫的程度。與Control組比，LPS組W/D值顯著升高，WOG組W/D值顯著低于LPS組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖1。

2.2 WOG對LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織病理學(xué)變化的影響 LPS刺激24 h后，與Control組相比，LPS組小鼠肺部有大量炎性細胞浸潤（中性粒細胞和巨噬細胞），肺組織間隙可見大量紅細胞滲出及肺泡壁增厚。與LPS組相比，WOG組小鼠上述病理變化均有明顯改善，見圖2。

圖1 3組肺組織W/D比較

2.3 WOG對ALI小鼠BALF中中性粒細胞、巨噬細胞水平的影響 LPS氣管灌注造模24 h后，流式細胞儀檢測小鼠BALF中炎性細胞（巨噬細胞、中性粒細胞）數(shù)量。LPS組中巨噬細胞和中性粒細胞的濃度與Control組比顯著增高（P＜0.01）；與LPS組比，WOG組巨噬細胞、中性粒細胞的水平均顯著降低（P＜ 0.01）。見圖3。

2.4 WOG對ALI小鼠BALF中細胞因子的影響 LPS氣管灌注造模24 h后，測定BALF中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的水平。與Control組比，LPS組BALF中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α表 達水平明顯升高，WOG組BALF中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α表達水平較LPS組明顯降低（P＜0.01），見圖4。

2.5 WOG對LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠NF-κB信號通路的影響 與Control組比，LPS刺激24 h后，LPS組小鼠肺組織IκB（inhibitor of NF-κB）顯著降解，導(dǎo)致磷酸化IκB（p-IκB）大量生成，WOG可明顯地抑制IκB的降解，阻斷NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活（P＜0.05），見圖5。

3 討論

ALI是由全身炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的綜合征，臨床表現(xiàn)彌漫性肺泡及肺血管內(nèi)皮細胞損傷、肺組織水腫及肺不張等病理特征，嚴重時可發(fā)展為ARDS。ALI病理改變主要體現(xiàn)在肺泡-毛細管屏障滲透性增加，炎癥細胞的細胞因子、趨化因子和黏附分子等炎癥介質(zhì)過量產(chǎn)生[5-7]。由于ALI發(fā)病機制不明確且預(yù)后不良，因此是呼吸危重癥醫(yī)學(xué)界研究的難點和熱點。本研究通過構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型，探究傳統(tǒng)中藥黃芪的主要藥理成分WOG治療ALI的潛在作用及機制，為WOG的臨床運用提供理論基礎(chǔ)。

圖2 小鼠肺組織病理切片（HE，×200）

圖3 流式細胞術(shù)檢測小鼠BALF中巨噬細胞和中性粒細胞水平

與Control組比：aP＜0.05；與LPS組比：bP＜0.05。每組5只

圖5 3組ALI小鼠NF-κB信號通路檢測

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，使用LPS進行小鼠滴鼻后可在肺組織募集包括中性粒細胞及巨噬細胞在內(nèi)的多種炎癥細胞，而此類炎癥細胞也可釋放TNF-10、IL-6等炎癥細胞因子，通過旁分泌的方式誘導(dǎo)中性粒細胞激活引起突發(fā)性呼吸、過氧化物酶釋放，最終加重肺部損傷[8]。因此，抑制免疫細胞過度活化和細胞因子的分泌是延緩ALI病程的關(guān)鍵。有研究表明，甘草黃酮、姜黃素等中藥能夠通過抑制炎癥細胞、抑制細胞因子分泌來治療ALI[9-10]，同時WOG已經(jīng)在皮膚炎癥、腦損傷等多種炎癥參與的動物疾病模型中被證明有治療效 果[3，11]。本研究則發(fā)現(xiàn)WOG對ALI亦有治療效果，動物實驗結(jié)果表明預(yù)先腹腔注射5 mg/kg的WOG，可減輕肺部炎性細胞浸潤（中性粒細胞和巨噬細胞）及顯著降低肺組織的W/D；流式細胞術(shù)及ELISA結(jié)果也顯示W(wǎng)OG治療后BALF中炎性細胞含量下降，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等促炎性細胞因子的產(chǎn)生減少。表明WOG可通過抑制機體免疫細胞的過度活化來對ALI起治療效果，且相較于臨床上使用激素治療ALI可能帶來的不良后遺癥，WOG或有更好的應(yīng)用前景。

參與ALI疾病發(fā)展的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程相對復(fù)雜，至今尚未完全明確，但有文獻初步報道NF-κB信號途徑在其中發(fā)揮著重要的作用[12-13]。革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分LPS可通過TLR4活化NF-κB信號通路啟動下游如炎性細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10）、黏附分子、集落刺激因子等炎癥信號的釋放，因此細菌感染也是導(dǎo)致ALI的重要病因[14-16]。 本研究發(fā)現(xiàn)，WOG可能通過抑制NF-κB信號通路的活化來緩解ALI的病情。Western blot結(jié)果表明：LPS刺激后，p-IκB水平升高，顯示NF-κB信號通路被激活；而在WOG預(yù)先處理的小鼠肺組織中p-IκB水平升高不明顯。因此，WOG處理的小鼠，可以通過抑制IκB磷酸化的方式抑制NF-κB信號通路的激活，進而影響下游的炎性細胞因子的釋放，并發(fā)揮相應(yīng)的治療效果。

本研究也存在一定的不足之處，例如未測定小鼠肺通氣量，細胞核及細胞質(zhì)中NF-κB的p65、p50兩個亞基的變化水平有待進一步分析，以及炎癥相關(guān)的趨化因子的變化水平也有待進一步探討。

綜上所述，WOG可通過抑制NF-κB信號通路的活化來減輕炎癥反應(yīng)，并發(fā)揮對LPS致小鼠ALI的保護作用。