響應(yīng)面優(yōu)化超聲波 微波協(xié)同提取鳳眼蓮黃酮工藝及其不同部位黃酮抗氧化活性分析

郭 瑩，周 穎，畢海丹，白 雪，毛鳴杰，高 蕾，車 笑

(棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東棗莊277160)

鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)，俗稱水葫蘆，繁殖力極強，屬雨久花科鳳眼蓮屬的多年生漂浮水生草本植物，原產(chǎn)地南美洲［1］。在20世紀30年代初，鳳眼蓮作為畜禽飼料被引進至國內(nèi)，逐漸發(fā)展成為水質(zhì)凈化及人們觀賞的花卉植物，后逃逸為野生［2］。目前鳳眼蓮被列為十大惡草之一，主要作為廢棄物、燃料、肥料或飼料［3－5］。目前對于鳳眼蓮的研究主要集中于利用鳳眼蓮治理河道或控制鳳眼蓮的惡性生長［6－8］，而對于其中生物活性物質(zhì)如多糖、類黃酮、超氧化物歧化酶(SOD)及保幼激素類似物等還有待更深入的開發(fā)。

黃酮作為鳳眼蓮中主要活性成分之一［9］，關(guān)于其提取和抗氧化性已有初步研究。目前黃酮化合物的新型提取方法很多，有微波萃取法［10－11］、超聲波法［12－13］、酶解法［14］、超臨界萃取法［15］、半仿生提取法［16］等，還可以將上述方法聯(lián)合使用進行提取，效果顯著。超聲波－微波協(xié)同提取技術(shù)是將超聲波振動的空穴作用與開放式微波的高能作用兩種方式相結(jié)合，具有快速、高效、不破壞分子結(jié)構(gòu)、適宜熱敏性和極性分子提取等優(yōu)點［17］，非常適合黃酮類化合物的提取研究。曾俊美等［18］研究了超聲波－微波協(xié)同法對龍眼殼中總黃酮提取率的影響，發(fā)現(xiàn)與超聲或微波輔助提取法相比，該方法更省時，總黃酮提取率更高。俞堅［19］應(yīng)用超聲－微波協(xié)同萃取/反應(yīng)儀研究了水芹葉總黃酮類化合物的工藝，發(fā)現(xiàn)其最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分數(shù)80%，液料比22∶1 mL/g，萃取功率563 W，萃取時間 4.2 min，此時，黃酮得率達44.7 mg/g。詹壽發(fā)等［20］利用超聲波－微波協(xié)同提取葎草總黃酮，其最佳工藝中提取時間為22 min，黃酮得率為3.472%。目前關(guān)于鳳眼黃酮提取的文章還較少，且對于其抗氧化能力也缺乏系統(tǒng)性的研究。

因此，本實驗以鳳眼蓮為原料，采用超聲波－微波協(xié)同提取鳳眼蓮黃酮，以黃酮得率為指標，以超聲波功率、微波功率、料液比和提取時間為考察因素，通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件，并研究其不同部位的黃酮化合物的抗氧化活性，為鳳眼蓮的深度開發(fā)和綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鳳眼蓮(Eichhornia crassipes) 6月份采于棗莊微山湖，60℃進行整株烘干以及分部位烘干，粉碎，過100目篩，避光保存，備用;蘆丁標準品(＞98%) 中國藥品生物制品檢定所;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、Tris、鄰苯三酚 均為分析純;1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH) Sigma 公司。

WFZ－UV2000紫外可見分光光度計 尤尼柯儀器有限公司;XO－SM100微波－超聲波組合聯(lián)用儀 濟南藍邁儀器有限公司;FD－1A－50真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;TGL－20A離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司;HH－4恒溫水浴鍋 上海躍進有限公司;PHS－3C精密酸度計 上海雷磁儀器廠;FA1104B電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;DFY－250高速萬能粉碎機 廣東佛山市方勝電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鳳眼蓮黃酮提取工藝 精確稱取鳳眼蓮粉末樣品，按照一定料液比加入60%乙醇，分別設(shè)置相應(yīng)的微波功率、超聲波功率和提取時間，于微波－超聲波組合聯(lián)用儀中進行提取，提取后真空抽濾，提取液備用。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 超聲波功率的選擇 精確稱取2 g鳳眼蓮粉末，60%乙醇作為提取溶劑，在料液比1∶20 g/mL，微波功率 400 W，超聲波功率分別為 200、400、600、800、1000 W的條件下于微波－超聲波組合聯(lián)用儀中提取20 min，真空抽濾得黃酮提取液，測定不同超聲波功率條件下鳳眼蓮黃酮得率。

1.2.2.2 微波功率的選擇 精確稱取2 g鳳眼蓮粉末，60%乙醇作為提取溶劑，在料液比1∶20 g/mL，超聲波功率 600 W，微波功率分別為 300、350、400、450、500 W的條件下于微波－超聲波組合聯(lián)用儀中提取20 min，真空抽濾得黃酮提取液，測定不同微波功率條件下鳳眼蓮黃酮得率。

1.2.2.3 料液比的選擇 精確稱取2 g鳳眼蓮粉末，60%乙醇作為提取溶劑，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL，在超聲波功率 600 W，微波功率400 W條件下于微波－超聲波組合聯(lián)用儀中提取20 min，真空抽濾得黃酮提取液，測定不同料液比條件下鳳眼蓮黃酮得率。

1.2.2.4 提取時間的選擇 精確稱取2 g鳳眼蓮粉末，60%乙醇作為提取溶劑，在料液比1∶20 g/mL，超聲波功率600 W，微波功率為400 W的條件下于微波－超聲波組合聯(lián)用儀中分別提取 5、10、15、20、25、30 min，真空抽濾得黃酮提取液，測定不同提取時間條件下鳳眼蓮黃酮得率。

1.2.3 鳳眼蓮黃酮提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以鳳眼蓮黃酮得率為響應(yīng)值，以超聲波功率(A)、微波功率(B)、料液比(C)和提取時間(D)四個因素為因變量，采用Box－Behnken設(shè)計方法對提取條件進行優(yōu)化，實驗因素及水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因素水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

1.2.4 鳳眼蓮黃酮得率的測定 將1.2.1制備的提取液用60%乙醇定容于100 mL容量瓶中。采用NaNO2－Al(NO3)3－NaOH顯色法測定鳳眼蓮黃酮含量，制作蘆丁標準曲線［21］，線性回歸方程為 A=0.9737C+0.001，R2=0.9993。鳳眼蓮黃酮得率的計算公式如下:

式中，c為提取液黃酮的含量(mg/mL);V為提取液的體積(mL);m為鳳眼蓮粉末重量(mg)。

1.2.5 抗氧化活性的測定 以響應(yīng)面實驗優(yōu)化的提取工藝參數(shù)為依據(jù)，分別對鳳眼蓮的根、莖、葉進行黃酮的提取、濃縮并真空凍干(溫度:－45～－50℃，真空度:10～40 Pa)，以70%乙醇溶液分別配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 質(zhì)量濃度梯度的樣品溶液，以總還原能力、DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率為評價指標進行鳳眼蓮黃酮抗氧化活性的分析。

1.2.5.1 總還原能力的測定 采用鐵氰化鉀還原法［22］。將2.5 mL的不同濃度梯度的樣液(黃酮的質(zhì)量濃度為0.1～0.8 mg/mL)與2.5 mL的磷酸鹽緩沖液(p H6.6)混合，加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀，50℃水浴中保溫20 min，快速冷卻，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，4000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，向其中加5 mL去離子水，與1 mL 0.1%三氯化鐵混合，充分振蕩，靜置10 min后于波長700 nm處測吸光值。取2.5 mL 70%乙醇溶液為空白對照液同以上操作參比調(diào)零，以吸光度表示總還原能力的大小。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力的測定 參照Oluwaseun等［10］的方法稍作修改，準確移取2 mL的90μmol/L DPPH的乙醇溶液，分別加入等體積樣液(黃酮的質(zhì)量濃度為0.1～0.8 mg/mL)于試管中，振蕩搖勻，以2 mL的90μmol/L DPPH的乙醇溶液為空白對照，室溫避光反應(yīng)30 min后在517 nm波長條件下測其吸光度，以70%乙醇溶液參比調(diào)零。DPPH自由基清除率(Y)的計算公式如下:

式中，A0為空白對照的吸光值;A為樣品的吸光值。

1.2.5.3 超氧陰離子自由基清除能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法［23］。取 5 mL 50 mmol/LTris－HCl(pH8.2)緩沖液，置于20℃水浴中預(yù)熱20 min，分別加入2 mL不同濃度梯度的樣液(黃酮的質(zhì)量濃度為0.1～0.8 mg/mL)，再加入1 mL 5 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻，在25℃水浴中反應(yīng)5 min，最后加入1 mL 10 mol/LHCl終止反應(yīng)，在320 nm處測定吸光度，對照組以蒸餾水代替鄰苯三酚溶液，空白組以蒸餾水代替樣液。超氧陰離子自由基清除率(Y)的計算公式如下:

式中，A為樣品的吸光值;A1為對照組的吸光值;A0為空白組的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實驗的平均值，單因素實驗數(shù)據(jù)和抗氧化實驗數(shù)據(jù)運用Sigma Plot 12.3軟件繪制趨勢曲線圖，響應(yīng)面實驗采用Design－Expert V8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)處理及相關(guān)分析，并優(yōu)化出最佳提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 超聲波功率對鳳眼蓮黃酮提取效果的影響由圖1可知，超聲波功率在200～600 W時，隨著功率增加，鳳眼蓮黃酮得率也隨之增大，這是因為隨著超聲波作用增強，超聲波的機械作用和空化作用等效應(yīng)增加了黃酮類化合物的溶出;當(dāng)功率為600W時，得率達到最大，此時黃酮得率為3.53%;但超過600 W后，黃酮得率反而下降，可能是因為，空化泡增長過快或數(shù)量過多，導(dǎo)致超聲波傳播速度減慢并且不易崩解，降低黃酮溶出速度，而且超聲波功率過高也使體系溫度急劇升高，可能導(dǎo)致部分黃酮結(jié)構(gòu)破壞［12］。所以超聲波功率在600 W左右為宜。

圖1 超聲波功率對鳳眼蓮黃酮提取效果的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the extraction efficiency of flavonoids from Eichhornia crassipes

2.1.2 微波功率對鳳眼蓮黃酮提取效果的影響 由圖2可知，微波功率在300～400 W時，隨著功率增加，鳳眼蓮黃酮得率也隨之增大，原因可能是微波功率提高導(dǎo)致提取溫度增高，高溫增加了細胞壁的滲透性，也增加了黃酮的溶解度和擴散系數(shù)，溶劑的粘度也下降［24］，使黃酮類物質(zhì)更易溶出;在微波功率為400W時，黃酮得率達到最大，此時得率為3.48%;而當(dāng)微波功率超過400 W后，隨著微波功率增大呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能是微波功率增加，在超聲波的加持下，體系溫度持續(xù)升高，造成部分黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)破壞［25］，并導(dǎo)致其他非黃酮類物質(zhì)大量溶出。所以微波功率在400 W左右為宜。

圖2 微波功率對鳳眼蓮黃酮提取效果的影響Fig.2 Effect of microwave power on the extraction efficiency of flavonoids from Eichhornia crassipes

2.1.3 料液比對鳳眼蓮黃酮提取效果的影響 由圖3可知，料液比在1∶10～1∶20 g/mL 范圍時，隨著溶劑量的增加，鳳眼蓮黃酮得率也隨之增大，這是因為增大了溶質(zhì)推動力，有利于黃酮類物質(zhì)的溶出，雖然鳳眼蓮黃酮得率明顯提高，但提取液量過少不利于后期過濾工作，黃酮損失率也較大;當(dāng)料液比在1∶20 g/mL時，黃酮得率達到最大，此時得率為3.49%;當(dāng)料液比繼續(xù)減少，鳳眼蓮黃酮得率降低，推斷原因是溶劑量增多雜質(zhì)成分溶出增多，影響了黃酮類物質(zhì)的浸出，黃酮提取量很快達到溶解平衡［26］，且料液比過小也不利于后期濃縮，增加了濃縮時間。因此料液比在1∶20 g/mL左右為宜。

圖3 料液比對鳳眼蓮黃酮提取效果的影響Fig.3 Effect of material－to－liquid ratios on the extraction efficiency of flavonoids from Eichhornia crassipes

2.1.4 提取時間對鳳眼蓮黃酮提取效果的影響 由圖4可知，提取時間在5～20 min范圍時，隨著時間的延長，鳳眼蓮黃酮得率逐漸提高，這是由于超聲－微波共同作用，各自優(yōu)勢體現(xiàn)較為明顯，得率迅速增加;在提取時間為20 min時，黃酮得率達到最大，此時得率為3.47%;但隨著時間延長，之后呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能是提取時間為20 min時大部分黃酮類物質(zhì)已經(jīng)溶出，時間繼續(xù)增長，使部分黃酮降解并伴隨著其他雜質(zhì)的大量溶出［18］，導(dǎo)致得率降低。所以提取時間在20 min左右為宜。

圖4 提取時間對鳳眼蓮黃酮提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction efficiency of flavonoids from Eichhornia crassipes

2.2 響應(yīng)面實驗

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果及方差分析 利用軟件Design－Expert 8.0.6中的Box－Behnken模式設(shè)計響應(yīng)面實驗，依據(jù)表1的因素與水平值，每個實驗組均進行多組平行實驗，減少誤差，實驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實驗結(jié)果的方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

2 1 －1 0 0 3.12 3.18 3 －1 1 0 0 2.35 2.32 4 1 1 0 0 2.02 1.98 5 0 0 －1 －1 2.13 2.19 6 0 0 1 －1 2.25 2.28 7 0 0 －1 1 2.19 2.19 8 0 0 1 1 3.43 3.39 9 －1 0 0 －1 2.48 2.36 10 1 0 0 －1 2.19 2.11 11 －1 0 0 1 2.69 2.60 12 1 0 0 1 3.03 2.98 13 0 －1 －1 0 2.74 2.68 14 0 1 －1 0 1.81 1.76 15 0 －1 1 0 3.32 3.20 16 0 1 1 0 2.64 2.53 17 －1 0 －1 0 1.97 2.01 18 1 0 －1 0 2.52 2.53 19 －1 0 1 0 2.97 3.11 20 1 0 1 0 2.62 2.72 21 0 －1 0 －1 3.14 3.15 22 0 1 0 －1 1.12 1.22 23 0 －1 0 1 2.53 2.57 24 0 1 0 1 2.78 2.91 25 0 0 0 0 3.45 3.55 26 0 0 0 0 3.58 3.55 27 0 0 0 0 3.57 3.55 28 0 0 0 0 3.58 3.55 29 0 0 0 0 3.56 3.55

利用Design－Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件對表2的實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到鳳眼蓮黃酮得率對編碼自變量超聲波功率(A)、微波功率(B)、料液比(C)和提取時間(D)的二次多項回歸數(shù)學(xué)模型是:

Y=3.55+0.033A－0.40B+0.32C+0.28D－0.20AB－0.23AC+0.16AD+0.063BC+0.57BD+0.28CD－0.48A2－0.53B2－0.48C2－0.56D2。

對回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3。該回歸模型極顯著(p＜0.0001)，失擬項不顯著(p=0.0780＞0.05)，說明該回歸模型與實驗數(shù)據(jù)的擬合程度較高，實驗誤差小。另外表2響應(yīng)值中黃酮得率與方程預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)為0.9224，模型決定系數(shù)R2=0.9857，校正決定系數(shù)=0.9714，擬合狀況良好，說明建立的回歸模型可行。對回歸方程系數(shù)進行顯著性檢驗，各因素對鳳眼蓮黃酮得率影響排序為:微波功率(B)＞料液比(C)＞提取時間(D)＞超聲波功率(A)。其中，影響極顯著(p＜0.01)的是一次項B、C、D、交互項 BD，以及二次項 A2、B2、C2、D2，影響顯著(p＜0.05)的是交互項 AB、AC、AD、CD，影響不顯著的是一次項A和交互項BC。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 等高線的性狀可以反映各因素間交互作用的強弱關(guān)系，由圖5可知，超聲波功率和微波功率、超聲波功率與料液比、超聲波功率與提取時間、微波功率與提取時間、料液比與提取時間的等高線均成橢圓形，說明這5組因素之間的交互作用均較明顯，但是微波功率與提取時間的交互作用比其他組的交互作用更加明顯，這與表3的顯著性分析一致。

圖5 各因素交互作用對鳳眼蓮黃酮得率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Three－dimensional response surface and contour plots showing the interactive effects of various extraction parameters on the yield of flavonoids from Eichhornia crassipes

2.2.3 驗證實驗 應(yīng)用響應(yīng)面軟件對回歸模型進行分析得到最優(yōu)提取條件為超聲波功率606.81 W，微波功率388.06 W，料液比1∶21.9，提取時間21.14 min，最大黃酮得率預(yù)測值為3.69%。因儀器設(shè)備條件及操作方便等原因?qū)ο嚓P(guān)參數(shù)條件進行調(diào)整，最優(yōu)條件為超聲波功率600 W，微波功率400 W，料液比1∶22，提取時間21 min，在此工藝條件下進行驗證實驗，得到鳳眼蓮黃酮得率為3.64% ±0.07%，與預(yù)測值相近，差異不顯著(p＞0.05)，說明回歸方程與實際情況擬合良好，充分驗證了回歸方程的可靠性。超聲波－微波協(xié)同提取鳳眼蓮黃酮的得率明顯高于黃映紅等［27］通過超聲波法提取鳳眼蓮黃酮的得率0.77%，說明超聲波－微波協(xié)同提取鳳眼蓮黃酮效果較好。

2.3 鳳眼蓮不同部位黃酮類化合物抗氧化活性比較

以響應(yīng)面實驗優(yōu)化的提取工藝參數(shù)為依據(jù)，分別對鳳眼蓮的根、莖、葉進行黃酮的提取，測定鳳眼蓮黃酮得率分別為鳳眼蓮根3.47% ±0.04%、鳳眼蓮葉3.62%±0.09%、鳳眼蓮莖3.38% ±0.03%。對不同部位的鳳眼蓮黃酮進行總還原能力、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力的測試，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，當(dāng)鳳眼蓮黃酮質(zhì)量濃度在0.1～0.8 mg/mL范圍時，不同部位提取的黃酮均具有抗氧化能力，且隨著質(zhì)量濃度的提高，均呈現(xiàn)能力增強的趨勢，當(dāng)處于同一質(zhì)量濃度條件時，鳳眼蓮不同部位黃酮的總還原能力、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力表現(xiàn)一致，依次為葉＞根＞莖。在黃酮質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，抗氧化能力最強，且三個指標的測試結(jié)果呈現(xiàn)較好的一致性。其中總還原能力(A700)測試中，葉的吸光值(1.18±0.01)＞根的吸光值(0.96±0.02)＞莖的吸光值(0.81±0.02);DPPH自由基的清除能力測試中，葉的DPPH自由基清除率61.25%±0.77%＞根的DPPH自由基清除率51.65%±0.69%＞莖的DPPH自由基清除率48.41%±0.69%;超氧陰離子自由基的清除能力測試中，葉的超氧陰離子自由基清除率75.90%±1.26%＞根的超氧陰離子自由基清除率(60.91±1.26)% ＞莖的超氧陰離子自由基清除率56.39%±0.80%。采用IBM SPSS Statistics 23進行分析，清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基的 IC50分別為:鳳眼蓮葉0.569、0.389 mg/mL，鳳眼蓮根 0.754、0.555 mg/mL，鳳眼蓮莖 0.837、0.646 mg/mL。

圖6 鳳眼蓮不同部位黃酮的總還原能力(a)、DPPH自由基的清除能力(b)和超氧陰離子自由基的清除能力(c)Fig.6 Total reduction ability(a)，DPPH free radical scavenging ability(b)and superoxide anion free radical scavenging ability(c)of flavonoids from the different parts of Eichhornia crassipes

3 結(jié)論

采用超聲波－微波協(xié)同提取鳳眼蓮黃酮類化合物，利用Design－Expert 8.0.6軟件對黃酮類化合物得率的二次回歸模型進行設(shè)計分析，結(jié)果表明模型擬合程度較高，通過單因素及響應(yīng)面實驗優(yōu)化確定鳳眼蓮黃酮最優(yōu)提取條件為超聲波功率600 W，微波功率400 W，料液比1∶22，提取時間21 min，在此工藝條件下得到鳳眼蓮黃酮得率為3.64% ±0.07%。通過此最佳工藝對鳳眼蓮不同部位黃酮進行提取，并進行體外抗氧化活性比較，評價指標為總還原能力、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力，結(jié)果表明鳳眼蓮不同部位黃酮的三個抗氧化能力指標測試的結(jié)果具有一致性，抗氧化能力由高到低依次為葉、根和莖。清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基的 IC50分別為:鳳眼蓮葉0.569、0.389 mg/mL，鳳眼蓮根0.754、0.555 mg/mL，鳳眼蓮莖 0.837、0.646 mg/mL。鳳眼蓮黃酮具有較好的抗氧化能力，可進一步的開發(fā)利用。