MicroRNA在法庭科學(xué)鑒定中的最新應(yīng)用研究

劉 卓， 賈振軍

(中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 北京 100038)

0 引言

MicroRNA (miRNA)是一類內(nèi)源性表達、平均片段長度約為22nt的非編碼小分子RNA。miRNA廣泛存在于各種真核組織和體液中，它們靶向結(jié)合互補的mRNA序列，促進了mRNA的降解或者抑制了mRNA的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)了基因表達[1,2]。

miRNA的表達調(diào)節(jié)了一系列生物學(xué)過程，包括有機體的發(fā)育、組織器官的分化、疾病的發(fā)生等[3-13]，其表達模式蘊含了豐富的生物學(xué)信息。此外，miRNA在各種類型的樣本中都能較為完好的保存，血漿、尿液甚至福爾馬林固定過的組織中都可以提取到miRNA，且目前檢測其表達水平的技術(shù)手段具有很高的靈敏度[14]。這些特點都表明miRNA可成為良好的生物標(biāo)記分子。

在法庭科學(xué)領(lǐng)域，大量研究已發(fā)現(xiàn)不同體液或者組織中的miRNA表達譜具有差異性[15-24]，可據(jù)此進行體液或組織來源的鑒定，還有研究表明可通過miRNA表達的特異性變化推測死亡方式[25]。近年來，隨著miRNA檢測技術(shù)的進步，在此領(lǐng)域又有了很多新的研究成果。

1 MicroRNA檢測技術(shù)

傳統(tǒng)的miRNA檢測技術(shù)包括微陣列方法(microRNA microarray)和定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)。前者基于核酸雜交技術(shù)，先對樣本中提取的miRNA進行熒光標(biāo)記，再將這些miRNA與DNA探針進行雜交，篩選出樣本中的miRNA；后者是先將樣本中提取的miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后再對cDNA進行PCR并實時監(jiān)控PCR產(chǎn)物量的累積，通過生成的PCR產(chǎn)物的水平來反映原樣本中miRNA的表達水平。通常將兩種方法結(jié)合起來，即先通過微陣列篩選出不同樣本中表達水平差異性較大的若干個miRNA分子，再通過定量反轉(zhuǎn)錄PCR對篩選出的miRNA分子進行確認。近些年來，高通量測序方法應(yīng)用到miRNA的檢測中，即先通過反轉(zhuǎn)錄獲得樣品miRNA的cDNA庫, 接著對cDNA庫進行高通量測序，測序的過程中讀取不同序列的miRNA分子的相對含量，以此獲得樣本中miRNA的表達譜。3種方法中，只有高通量測序方法可用于新miRNA分子的發(fā)現(xiàn)，并且可以很好的區(qū)分序列相似的miRNA分子。

2 MicroRNA在法庭科學(xué)鑒定中的最新研究

2.1 鑒定體液或組織來源

大量的研究表明不同體液來源的miRNA分子表達譜具有顯著性差異[19, 21, 23, 24, 26-29]。表1展示了一些研究中發(fā)現(xiàn)的常見體液(血液、精液、唾液、陰道分泌液)中特異性表達的miRNA分子，但比較后會發(fā)現(xiàn)不同的研究小組所得出的結(jié)果不完全相同，即標(biāo)記同一種體液的miRNA分子有區(qū)別，造成這種差異的原因可能是檢測的技術(shù)方法以及使用的引物等的不同。為了使鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確可靠，研究者們還引入了一些算法模型來計算miRNA分子的表達水平，通過計算結(jié)果來進行體液來源鑒定[20, 26]。

通過miRNA鑒定體液來源還可與DNA分型同時進行。van der Meer等人使用毛細管電泳的方法進行miRNA分型。他們從血液和唾液中提取DNA和miRNA，接著通過反轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA，得到了包含DNA和cDNA的混合提取物。使用毛細管電泳的方法對提取物進行標(biāo)準(zhǔn)的STR分型，除了得到DNA分型圖譜外，血液樣本的STR分型圖譜都包含一個表征血液的miRNA峰，而唾液的STR分型圖則包含了表征唾液的miRNA峰[30]。

與傳統(tǒng)的微陣列方法相比，高通量測序方法具有更準(zhǔn)確(不易出現(xiàn)假陽性結(jié)果)、更全面(能夠發(fā)現(xiàn)新的miRNA分子)的優(yōu)勢?；谶@種方法，Wang 等人的研究找到了6種用于鑒定靜脈血的miRNA分子和19種用于鑒定唾液的miRNA分子[31]，其中一部分和前人的研究結(jié)果一致，另一部分則完全不同(表1)，這可能是由于高通量測序方法找到了之前研究中使用傳統(tǒng)檢測方法沒有發(fā)現(xiàn)的miRNA分子，但這些研究結(jié)果還有待進一步證實。

表1 miRNA在體液中的差異性表達

除了鑒定體液來源外，miRNA分型還可用于通過痕量樣本確定器官或組織來源。Sauer等人的研究發(fā)現(xiàn)， miRNA分析能夠很可靠的區(qū)分器官組織(腦、腎、肺、肝、心肌、骨骼肌、皮膚)，同時不影響DNA分型的操作。因此可以作為DNA分型的補充，分析一些實際的混合樣本、降解樣本以及槍擊或者穿刺后產(chǎn)生的痕量樣本[32]。

2.2 為還原案情提供線索

除了作為潛在的分子標(biāo)記進行體液或組織來源鑒定外，miRNA還能為案件還原提供一些重要信息。Johnson等人使用大鼠作為動物模型，使用棉簽收集大鼠頭部槍傷后形成的血跡斑可檢測到腦組織的分子標(biāo)記miR-124-3p，這意味著可以通過miR-124-3p來鑒定遺留在現(xiàn)場的血痕是來源于頭部槍傷還是胸部槍傷，這就為還原案情提供了重要信息[33]。在后續(xù)研究中，他們用刀片在大鼠的肝部造成貫穿傷，檢測傷口流出的血液中是否有肝組織的標(biāo)記分子 rno-mir-122-3p，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在使用的刀片上提取微量樣本，其中有67%能夠檢測出rno-mir-122-3p，而在滴出的血液中也有57%能夠檢測到rno-mir-122-3p[34]。這些結(jié)果都表明可以通過miRNA來鑒定血痕來源的組織，為還原案件的發(fā)生過程提供信息。

2.3 通過microRNA推測死亡方式

疾病發(fā)生和外界刺激都會引起miRNA的表達發(fā)生變化，這使miRNA可能成為鑒定死亡原因的分子標(biāo)記。Yu等人使用小鼠溺亡模型，發(fā)現(xiàn)有8種特異性的miRNA分子在淡水中溺亡的小鼠腦部表達增加，而在海水中溺亡的小鼠腦部表達下降[25]。其中，miR-706(靶向HCN1)在淡水中溺亡的小鼠腦中的表達顯著高于海水中溺亡小鼠。Menathung等人檢測了急性心肌梗塞死亡后的人血樣，發(fā)現(xiàn)和對照組相比，miR-499的表達水平顯著增加[35]。這些結(jié)果都表明可通過miRNA分子的表達變化來推測可能的死亡原因，為法庭科學(xué)取證提供了新的思路。

2.4 通過microRNA鑒定涉毒和吸毒史

成癮藥物例如嗎啡、可卡因和安非他明等的使用會引起miRNA分子的表達譜發(fā)生變化[36-40]。這些相關(guān)的研究結(jié)果除了揭示成癮相關(guān)的生物學(xué)機制外，還提示miRNA分子能夠作為診斷藥物成癮或者鑒定涉毒的生物標(biāo)記物。如在海洛因依賴的患者群體中，其外周血單核細胞中的一些miRNA分子如miR-582-5p、miR-590-5等的水平與健康人相比是下降的[37, 41]；海洛因濫用者血漿中的miRNA分子表達譜也發(fā)生了特異性的變化，有11種miRNA分子表達水平上升，有9種miRNA分子表達水平下降[36]。除了海洛因之外，甲基苯丙胺濫用病人血漿中的miRNA表達譜也得到了研究。與健康人群相比較，甲基苯丙胺濫用病人血漿中miR181a、miR15b、miR-let-7e和miR-let-7d的表達明顯下降，更有趣的是，這種變化程度與過去數(shù)月中的藥物使用頻率呈負相關(guān)[42]。

上述研究結(jié)果都提示特定的miRNA分子及特異性的miRNA表達譜都有望成為鑒定涉毒和毒品濫用史的新型生物標(biāo)記物。如果能夠進一步對各類濫用毒品人群的血漿miRNA或血細胞miRNA的表達譜進行充分研究，并找到其與藥物使用頻率之間的關(guān)聯(lián)性，那么miRNA分子將可能成為鑒定毒品濫用、推斷個體身份和識別個人背景的有力證據(jù)。

3 問題和展望

miRNA作為一種生物標(biāo)記分子，在鑒定體液來源、還原案情、推斷死亡方式以及鑒定涉毒等方面擁有潛在的應(yīng)用價值，但目前仍然存在一些明顯的問題，其中最大的挑戰(zhàn)莫過于使用的檢測手段等的不同可能會造成檢驗結(jié)果不一致的情況。因此，要使miRNA分子作為新型生物標(biāo)記物應(yīng)用在法庭科學(xué)領(lǐng)域，還需要大量的研究工作作為理論基礎(chǔ)，同時需要規(guī)范化的技術(shù)流程和技術(shù)平臺，做到如同DNA分型一樣，能夠在任何實驗室得到一致并且可靠的鑒定結(jié)果。雖然目前miRNA作為生物標(biāo)記分子的應(yīng)用還不成熟，但其作為小分子具有明顯的操作優(yōu)勢，并且蘊含了很多DNA分子所不能提供的豐富信息，相信以后隨著技術(shù)的進步和進一步研究的投入，它們在未來的法庭科學(xué)鑒定中將會發(fā)揮巨大的應(yīng)用價值。