常見烏頭類生物堿涉案檢材及前處理技術(shù)

鐘世豪， 任昕昕， 于忠山

(1.中國(guó)人民公安大學(xué)， 北京 100038; 2.公安部物證鑒定中心， 北京 100038)

0 引言

毛茛科植物常用在中藥中，可入藥的成分絕大部分存在于翠雀屬和烏頭屬植物當(dāng)中[1]，將烏頭、附子等植物作為藥物使用在我國(guó)多個(gè)醫(yī)家學(xué)派中均有悠久的歷史[2]。世界范圍內(nèi)有超過300種的烏頭屬植物[3]，僅在中國(guó)境內(nèi)的毛茛科植物就多達(dá)200多種[4]。毛茛科植物塊莖構(gòu)成的復(fù)方中藥通常具有較高的抗炎[5]、止痛溫經(jīng)[6]、除濕祛風(fēng)[7]等效果，是飽受頭風(fēng)喉痹和各種風(fēng)濕類風(fēng)濕病痛患者的良方[8]，同時(shí)對(duì)腸胃炎、腹瀉、水腫[9]、腫瘤[10]以及支氣管哮喘[11]等病癥均有一定的療效。毛茛科植物本身的作用可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于此，有很多最新研究表明烏頭類植物所含的藥用成分可能對(duì)其他免疫或病因不明的疾病具有良好的抑制和緩解作用，亦可改善衰竭心臟心率[12]。烏頭堿類化合物在合成工業(yè)上也具有很大的意義，諸如使用烏頭堿制備昂貴的BCD環(huán)狀體系[13]。

古著醫(yī)術(shù)中常說是藥三分毒[14]，毛茛科植物雖然藥用前景廣泛，但作用機(jī)理[15]及治療窗[16]尚且不明，即使是專業(yè)醫(yī)師也對(duì)毛茛科植物在醫(yī)用用量上也十分謹(jǐn)慎[17]，主要原因是毛茛科植物所含的藥用活性成分烏頭堿、滇烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等烏頭類生物堿，也是毒性成分[18]，烏頭類生物堿毒性極大[19-21]。烏頭類生物堿中毒性最強(qiáng)的當(dāng)屬烏頭堿，其LD50為0.308 mg/kg[22]。生物對(duì)于烏頭類生物堿的個(gè)體耐受性差異較大[23]，對(duì)于一個(gè)健康的成人的致死劑量約為1～2 mg[24]。毛茛科植物作為藥物如果處理不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致其中所含的劇毒成分烏頭類生物堿仍有過量殘留，進(jìn)入生物體后會(huì)影響鉀離子和鈣離子的延時(shí)整流效應(yīng)[25]，造成服用者心室纖維顫動(dòng)[26]，對(duì)心臟、神經(jīng)、肝臟細(xì)胞均有作用[27]，危及使用者的身體健康或形成更嚴(yán)重的后果。

烏頭類生物堿中毒后一般在血液、尿液及肝臟中都可以檢測(cè)出，在法庭科學(xué)領(lǐng)域，常見烏頭類生物堿涉案檢材是根據(jù)中毒后客體的狀態(tài)選擇合適檢材進(jìn)行分析，一般選擇血液、尿液以及肝臟。

1 烏頭類生物堿中毒的常見原因

烏頭類生物堿毒性極強(qiáng)，毒性分級(jí)上屬于劇毒，解毒機(jī)制尚不明確[28]，目前沒有解毒特效藥，因此在烏頭類生物堿中毒的解毒和救治上面臨諸多困難[29]。鑒于以上原因，烏頭類生物堿也常被用自殺和他殺案件中。其中毒癥狀與心臟病所產(chǎn)生的癥狀十分類似[30]，因此使用烏頭類生物堿投毒的案件在判斷上也具有一定的迷惑性。

烏頭、附子等植物常被作為復(fù)方藥劑和炮制藥酒等過程中用到的原材料[31]，在治療風(fēng)濕骨病、跌打腫痛方面也有很高的療效。由于很多民眾知道此類藥物在各種病癥方面的療效，但沒有意識(shí)到其潛在的毒害性，對(duì)此藥物在使用時(shí)處理不謹(jǐn)慎，導(dǎo)致意外事故的發(fā)生。雖然泡制烏頭酒在治療疼痛炎癥上有很好的療效[32]，但藥材處理不規(guī)范，用量不當(dāng)極易引發(fā)中毒的意外，且酒精也會(huì)協(xié)同藥材中的烏頭類生物堿，使其毒性增強(qiáng)[33]。在中國(guó)的一些山區(qū)甚至有將草烏和川烏這類有劇毒的毛茛科植物作為食材，與禽畜肉燉煮后食用的習(xí)慣[34]。另外在我國(guó)云南等地常常有當(dāng)?shù)鼐用袼阶圆烧獮躅^、附子等植物，經(jīng)過簡(jiǎn)單的炮制處理后直接當(dāng)做藥物使用，但炮制過程常不遵循中藥炮制國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[35-36]，導(dǎo)致藥物仍有一定毒物殘留危及使用者健康及生命。少數(shù)事故中也有混淆植物種類，誤食含有烏頭類生物堿的植物而造成悲劇[37-38]。

結(jié)合中毒原因和相關(guān)法律，在刑事科學(xué)領(lǐng)域?qū)躅^類生物堿涉案檢材前處理及檢測(cè)方式的研究也至關(guān)重要。

2 常見案件及其檢材

含烏頭類生物堿的藥物種類多樣，烏頭類生物堿在自殺他殺案件中投毒的客體也有差異，根據(jù)法規(guī)[39]被投放毒物的物質(zhì)也要接受檢驗(yàn)。犯案過程中使用的容器也是檢測(cè)的對(duì)象。

對(duì)于生物體而言，烏頭類生物堿涉案檢材一般選擇血液或肝臟。個(gè)別案例中，中毒對(duì)象仍然存活，但由于烏頭類生物堿在活體體內(nèi)代謝速度快，超過24 h后，生物體內(nèi)的血液難以成為烏頭類生物堿定性定量的的首選，但生物體的尿液在服用烏頭類生物堿的連續(xù)6天的時(shí)間里都能檢測(cè)出待測(cè)物[40]，此時(shí)也會(huì)根據(jù)情況選擇尿液檢測(cè)。生物體在攝入烏頭類生物堿后，3小時(shí)內(nèi)臟器濃度膽囊>肝臟>腎臟>肺和脾，3小時(shí)后主要集中在肝臟[41]。

鑒于烏頭類生物堿劇毒，且在誤食、他殺自殺案件中常有涉及，對(duì)于生物體而言，3種(血液、尿液以及肝臟)常見烏頭類生物堿涉案檢材的研究具有很大的意義。血液為生物體中常見組織液，毒素通過血液的循環(huán)到達(dá)身體各處，烏頭類生物堿中毒者尿液中烏頭類生物堿的含量通常大于血液中的含量，且對(duì)于尿液中的烏頭類生物堿可檢測(cè)周期長(zhǎng)。肝臟是生物機(jī)體的重要代謝器官，所以肝臟是對(duì)人體有毒物質(zhì)攝入和代謝的重要研究器官[42]。

在部分案例中疑似服用不當(dāng)處理、或含有毒成分的藥物，在這些案例中藥粉、藥片乃至藥渣等[43-46]也會(huì)成為法庭科學(xué)的檢測(cè)對(duì)象。

3 常見檢材與相應(yīng)前處理技術(shù)

根據(jù)對(duì)常見烏頭類生物堿涉案檢材分析，可以看出烏頭類生物堿涉案的檢材具有一定復(fù)雜性。正是由其復(fù)雜性導(dǎo)致對(duì)于不同案件的檢材在預(yù)處理、分析手段及定性定量效果方面都不近相同。

由于烏頭類生物堿的理化性質(zhì)，烏頭類生物堿涉案檢材具有一定的特殊性，多種烏頭類生物堿都在堿性、水中以及高溫的條件下極易分解[47]，即雙酯型二萜生物堿轉(zhuǎn)化單酯型二萜生物堿及胺類生物堿[48]，這也是炮制處理烏頭、附子等毛茛科植物過程中，各種烏頭類生物堿之間的化學(xué)轉(zhuǎn)化情況。常見具有藥物活性的烏頭類生物堿結(jié)構(gòu)見表1。正是由于經(jīng)常涉案的幾種烏頭類生物堿具有這種特殊性質(zhì)，在刑事科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域甚至其他領(lǐng)域?qū)ζ涞难芯慷歼x不易破壞檢材的方法進(jìn)行定性和定量。

表1 常見4種烏頭堿結(jié)構(gòu)

待測(cè)物質(zhì)的理化性質(zhì)決定了對(duì)目標(biāo)物的分析方法，不同的分析方法的處理方法有所不同。因此，可用分析方法為各種前處理技術(shù)進(jìn)行分類，淺談各種常見前處理手段的利弊。

3.1 液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用的常用前處理方法

液相色譜法具有可以分析難揮發(fā)、易分解的物質(zhì)的能力。根據(jù)烏頭類生物堿的理化性質(zhì)，經(jīng)過適當(dāng)前處理后，常使用液相色譜分析烏頭類生物堿引發(fā)的案件檢材。單一使用液相色譜在物質(zhì)定性方面有所欠缺，因此經(jīng)常和質(zhì)譜等儀器聯(lián)用，不但彌補(bǔ)了液相色譜在定性能力上的不足，更彌補(bǔ)了質(zhì)譜在定量能力上的欠缺，兩種類型的儀器互相取長(zhǎng)補(bǔ)短，更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的分析[49]，對(duì)于烏頭類生物堿的檢測(cè)也有實(shí)驗(yàn)選擇高壓液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用法[50]。

在液相色譜或者液相色譜- 質(zhì)聯(lián)用作為分析儀器時(shí)前處理方式也不盡相同，根據(jù)檢材、儀器條件等因素前處理方式會(huì)有變化。

對(duì)于血液和尿液檢材在使用液相色譜時(shí)，方法的差異主要集中在如何將血液和尿液進(jìn)行前處理，要達(dá)分析儀器進(jìn)樣的要求。

血液檢材在前處理沉淀蛋白階段常用甲醇、丙酮、乙酸乙酯以及各種無機(jī)鹽、乙腈或乙腈和甲醇等[51-52]物質(zhì)進(jìn)行混合對(duì)檢材進(jìn)行處理，其中乙腈和甲醇為首選，甲醇提取也不會(huì)引起電離抑制[53]。流動(dòng)相選擇為堿性的條件下，也會(huì)選用乙酸銨和氨水的混合溶液緩沖pH為9后加入甲醇后進(jìn)行超聲處理的方式沉淀蛋白[54],但是選擇高pH的沉淀蛋白方法可能會(huì)造成易水解的烏頭類生物堿的不穩(wěn)定。傳統(tǒng)乙腈沉淀蛋白為使用率最高的方法，但是對(duì)血液中的烏頭類生物堿的提取回收率普遍在72%～85%[55]。

大多數(shù)實(shí)驗(yàn)方法中會(huì)選擇離心作為下一步操作，但在較新的研究成果中也有選用在線固相萃取技術(shù)對(duì)檢材進(jìn)行進(jìn)一步的處理，不但可以處理血液檢材，對(duì)尿液檢材也有很好的效果，快捷高效[56]。另外采用中空纖維固相微萃取[57]技術(shù)對(duì)于痕量檢材的預(yù)處理和保護(hù)性也有一定的提升，技術(shù)也在逐步開發(fā)和應(yīng)用在此類檢材的處理中。

通過上述操作后將待測(cè)液體過膜處理，但在有些文獻(xiàn)的處理中選擇在過膜后通氮?dú)獯蹈?，并用初始流?dòng)相定容到合適的濃度后進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，這樣可以明顯改善基質(zhì)效應(yīng)[58]。對(duì)于烏頭類生物堿藥物中毒案件血液檢材的預(yù)處理也在不斷地改善。使用液相色譜或者液相色譜- 質(zhì)譜分析各種毒物涉案案件中的生物檢材，處理方法都有一定相似，但在細(xì)節(jié)處理上有一定的差異。

而對(duì)于藥片、藥粉以及藥渣等組成有一定復(fù)雜性的檢材，也會(huì)使用液相色譜或液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行分析。處理方法比較血液處理方式相比差異較大。

常見對(duì)于可能含有烏頭類生物堿的藥片、藥粉、藥渣等檢材的處理一般先選取適檢材，將其研磨成粉狀后過適當(dāng)篩目篩子[59]，舍棄大體積藥材并取篩下藥粉利用去離子水浸泡一定時(shí)間后加熱回流，萃取得到檢材中的有效成分。吹干后加入合適的溶劑或流動(dòng)相定容，透過0.22 μm微孔濾膜，最終得到可以利用液相色譜檢測(cè)的檢材[60]。檢材過篩后加入乙腈超聲提取，離心后進(jìn)樣分析[61]也對(duì)處理含有烏頭類生物堿的藥片、藥粉以及藥渣的常用處理手段手段。

很多液體待測(cè)物都適用于利用固相萃取法進(jìn)行前處理[62]。因此，對(duì)于烏頭類生物堿涉案的藥片萃取液、血液以及尿液檢材也常選用固相萃取(SPE)法進(jìn)行前處理[63]，處理后便可直接進(jìn)樣。

3.2 氣相色譜及其聯(lián)用

使用氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀器進(jìn)行檢測(cè)含有烏頭類生物堿的生物樣本時(shí)，檢材用乙腈進(jìn)行沉淀蛋白，鍵合到硅膠盒上，蒸發(fā)干燥后用BSTFA硅烷化或采用裂解處理后進(jìn)樣[64]。由于氣相色譜分析烏頭類生物堿需要進(jìn)行衍生化后進(jìn)樣，大大加大了前處理時(shí)間和成本，因此利用色質(zhì)譜聯(lián)用處理烏頭類生物堿涉案檢材方法漸漸被其他方式取代。

3.3 直接使用質(zhì)譜進(jìn)行分析

利用質(zhì)譜進(jìn)行分析主要是根據(jù)質(zhì)譜不同電離源有不同特性，例如ESI-MS/MS對(duì)質(zhì)子親和勢(shì)能較高的生物堿有較強(qiáng)的分析能力，并利用丟失的中性脂肪酸特征來推測(cè)其結(jié)構(gòu)[65]。通過質(zhì)譜圖中的相對(duì)豐度信息也可以定量。

直接使用各種質(zhì)量分析器的質(zhì)譜法對(duì)涉案檢材進(jìn)行分析的前處理與使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析的相關(guān)處理有一定的相似性，無論是血液檢材還是待測(cè)藥物本身，都要選用合適沉淀蛋白試劑將內(nèi)部的雜質(zhì)和影響檢測(cè)的蛋白質(zhì)除去。離心后取樣進(jìn)入質(zhì)譜(大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中基本只選用過膜作為第二步處理，并在處理后直接進(jìn)樣)，處理方式與使用液相色譜或液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行檢測(cè)相比較為簡(jiǎn)單。

而對(duì)于直接使用質(zhì)譜法進(jìn)行分析所采集的信息多為質(zhì)譜的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖，并用兩級(jí)質(zhì)譜的m/z進(jìn)行定性。并通過其相對(duì)豐度判定是否為主要物質(zhì)。

質(zhì)譜法檢測(cè)烏頭類生物堿涉案檢材方法簡(jiǎn)單快捷[66]，但僅僅適合簡(jiǎn)單推算物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，或者對(duì)于大體成分已知的藥物檢材中的某一疑似物質(zhì)的檢測(cè)，在實(shí)際案件的使用中，可以對(duì)檢材的檢測(cè)起到一定輔助作用，由于規(guī)范性和行標(biāo)的約束，單一使用質(zhì)譜進(jìn)行定性雖然有可行性，但一般只用于初步檢測(cè)和試探性檢測(cè)。

4 烏頭類生物堿涉案檢材前處理技術(shù)前瞻

涉及烏頭類生物堿的案件繁多。日常案件中烏頭類生物堿涉案檢材面臨著內(nèi)部成分烏頭類生物堿的分解[67]，因此對(duì)于含有烏頭類生物堿的檢材及樣品保存和預(yù)處理上都有建立在其穩(wěn)定性上的要求[68]。應(yīng)在預(yù)處理階段盡可能降低基質(zhì)對(duì)于檢材待測(cè)物檢出的影響的同時(shí)，把優(yōu)化建立在考慮到物質(zhì)的穩(wěn)定性的基礎(chǔ)之上。研究烏頭類生物堿的分解速率對(duì)于檢材原始含量的推算，以及涉及烏頭類生物堿案件檢材的最理想保存條件的確定都有重大的意義。檢材的預(yù)處理是影響檢材作為證據(jù)的關(guān)鍵一步。2003年美國(guó)農(nóng)業(yè)部研發(fā)的QuEChERS前處理法簡(jiǎn)單、方便，所以對(duì)于檢材和其他待檢測(cè)物品的預(yù)處理逐年以來越來越成為人們研究的重點(diǎn)方向之一[69]。但對(duì)于烏頭類生物堿涉案案件和事故中的檢材能否適用于QuEChERS方法，能否將QuEChERS方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)或者與傳統(tǒng)檢材的處理方式相結(jié)合，是個(gè)值得深入研究的問題。凝膠電泳對(duì)于液體檢材的檢測(cè)改善基質(zhì)效應(yīng)，一定程度提升檢測(cè)限[70]，但能否適用于烏頭類生物堿也待考證。

因前處理手段與回收率、檢測(cè)限有很大的關(guān)系。回收率更高的前處理技術(shù)，也是還原案件真相更加有利的技術(shù)。在法庭科學(xué)領(lǐng)域若能將高回收率的前處理技術(shù)與高靈敏度的檢測(cè)方法相結(jié)合，能夠大幅度提升檢測(cè)限，接近檢材的真實(shí)濃度，還原案件真實(shí)情況。