瑞香素體外抗腸道病毒71型的初探*

鄧慧敏， 熊英， 傅穎媛， 況南珍△

1南昌大學基礎醫(yī)學院(江西南昌 330006); 2江西省疾病預防控制中心疾病檢驗所(江西南昌 330029)

手足口病(hand foot and mouth disease, HFMD)作為一種兒童傳染性病，好發(fā)生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等多個部位出現(xiàn)皰疹，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜炎等并發(fā)癥，病情嚴重時可導致患兒死亡[1]。HFMD由糞-口途徑傳播，柯薩奇病毒A16型(Cox A16)和腸道病毒71型(EV71)是其最為常見病原體來源[2]。與Cox A16相比，EV71具有神經毒性作用，能引起神經系統(tǒng)疾病和死亡，已有相關死亡病例被報道[3]。EV71是正二十面體的球形結構，由近7 500 bp的單股正鏈RNA基因構成，編碼11個蛋白(結構蛋白VP1-4和非結構蛋白2A-C，3A-D)[4]。近幾年研究已證實EV71的毒力主要與結構蛋白VP1相關，VP1的表達水平也在一定程度上代表病毒的復制能力，但至今EV71的靶點——神經毒性的抗原決定簇尚未被查證。目前，臨床上也沒有特效的疫苗和抗病毒藥物來預防治療EV71引起的HFMD，主要以對癥治療(免疫球蛋白靜脈注射)為主，從而控制HFMD的發(fā)展和并發(fā)癥[5]。天然植物中發(fā)現(xiàn)了許多具有抗病毒活性的有效成分，可應用于病毒感染類疾病的治療[6-7]。金邊瑞香主要包括香豆素類、木脂素類、雙黃酮類三大化合物，具有抗炎[8-10]、抗氧化[11-12]、治療糖尿病[13-14]、保護神經[15]和缺血再灌注損傷恢復[16-17]等藥理作用。瑞香素(daphnetin, DAP)系香豆素類化合物，是從天然植物金邊瑞香中提取的活性成分，本實驗室長期從事該活性成分的研究，已經證實了瑞香素具有抗腫瘤[18]、抗炎[19]等作用，但鮮有文獻報道關于瑞香素的抗病毒作用。因此，本實驗室2013—2016年立足本省盛產資源，主要探討瑞香素體外抗EV71復制的影響，為瑞香素治療EV71感染的HFMD提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人惡性胚胎橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)由江西省疾病預防控制中心病毒所提供。

1.1.2 病毒株 EV71(編號：SZK2141/2012)由江西省疾病預防控制中心病毒所提供并分離培養(yǎng)，在人RD細胞中進行擴增，經過3次凍融后離心(12 000×g，10 min),取上清，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 藥物 瑞香素購自上海士峰生物科技有限公司，純度≥98%。利巴韋林(ribavirin, RVB)購自天津藥業(yè)集團新鄭股份公司，純度≥98%。

1.1.4 試劑和儀器 含鏈霉素青霉素高糖MEM培養(yǎng)液(北京Solarbio科技有限公司)；胎牛血清(美國GIBCO公司)；DMSO(天津大茂化學試劑廠)；Cell Counting Kit-8(上海BestBio貝博生物)；0.25%胰酶(美國GIBCO公司)；EV71核酸測定試劑盒(上海之江生物科技有限公司)。二氧化碳培養(yǎng)箱(湖南長沙長錦科技有限公司)；凈化工作臺(蘇州凈化設備廠)；倒置顯微鏡(XSZ-D重慶光學儀器廠)；紫外分光光度計(美國Thermo Scientific公司)；7500 Fast實時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 嚴格按照細胞培養(yǎng)無菌操作要求，對RD細胞進行復蘇培養(yǎng)、傳代至第3代，使細胞處于對數(shù)生長期。RD細胞的培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的MEM 高糖培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 病毒擴增 10%胎牛血清MEM生長培養(yǎng)基培養(yǎng)RD細胞，至細胞鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底后，2%胎牛血清MEM維持培養(yǎng)基，接種200 μL EV71病毒液，置37℃、5%CO2孵育至細胞病變效應(CPE)達“+++～++++”(細胞病變達75%～100%)。經過3次凍融后離心(4℃，12 000×g，10 min)，去除細胞碎片，取上清，分裝，每支0.5 mL，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病毒滴定 取1×105·mL-1的RD細胞100 μL加入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔約1×104個細胞，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，長滿成單層后(約48 h)，接種病毒；將病毒原液用MEM維持培養(yǎng)基按10倍倍比稀釋(10-1，10-2，……10-8)100 μL/孔，加入已吸去培養(yǎng)基的96板中，嚴格按照要求培養(yǎng)，每日鏡下觀察細胞病變情況，培養(yǎng)7 d，確定細胞不出現(xiàn)明顯病變的最低稀釋濃度, 運用Karber法計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。公式如下：lgTCID50=L-D(S-0.5) (L：最高稀釋度的對數(shù)；D：稀釋度對數(shù)之間的差；S：陽性孔比率總和。)

1.2.4 瑞香素毒性檢測 按“1.2.3”方法常規(guī)培養(yǎng)RD細胞48 h至單層貼壁狀態(tài)；將瑞香素溶解于10 μL DMSO中，再用MEM維持培養(yǎng)基稀釋，使瑞香素的終濃度為40、30、25、20、15、12.5、10、7.5、6.25、5、3.125 μg/mL。各取100 μL加入到已經棄去培養(yǎng)液的RD細胞培養(yǎng)板上，每個濃度設置4個復孔，另設4孔正常細胞孔(MEM維持培養(yǎng)基代替藥物組)和空白對照孔(只加MEM維持培養(yǎng)基的調零組)，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)72 h，在培養(yǎng)結束前3 h于每孔加入10 μL CCK8溶液。酶標儀450 nm波長處讀取吸光度值(OD)。按以下公式計算RD細胞的存活率；得出瑞香素最大無毒濃度(TC0)，并用統(tǒng)計軟件SPSS的回歸法計算50% 細胞毒性濃度(TC50)。細胞存活率(%)=(藥物作用組平均OD值-空白對照組OD值)/(正常細胞組平均OD值-空白對照組OD值)×100%

1.2.5 瑞香素體外抗EV71檢測 實驗分組設為：(1)正常細胞組：不加藥物及EV71干預RD細胞；(2)病毒對照組：EV71+RD細胞；(3)瑞香素組：不同濃度的瑞香素+EV71+RD細胞(瑞香素濃度根據(jù)“1.2.4”測定的TC0和TC50為15、12.5、10、7.5、5、3.75、2.5、1.875、1.25、1 μg/mL)；(4)陽性藥物組：50 μg/mL RVB +EV71+RD細胞。將100 μL RD細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h后，吸棄上清液，分兩種給藥方式進行：(1)病毒感染后給藥：除正常細胞組加100 μL MEM維持培養(yǎng)基外,其余3組均加入100TCID50病毒100 μL吸附1 h，吸去病毒液后，病毒對照組更換成100 μL MEM維持培養(yǎng)基；瑞香素加入100 μL含不同濃度的瑞香素的MEM維持培養(yǎng)基；陽性藥物組100 μL 50 μg/mL RVB的MEM維持培養(yǎng)基。37℃和5% CO2條件下培養(yǎng)72 h。(2)病毒感染時給藥：將各組藥物(不同濃度的瑞香素及50 μg/mL RVB)與100TCID50病毒混合于MEM維持培養(yǎng)基中37℃孵育2 h，將100 μL混合液接種在RD細胞上。將兩種給藥方式下的96孔細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)72 h，在培養(yǎng)結束前3 h于每孔加入10 μL CCK8溶液。酶標儀450 nm波長處讀取吸光度值。按以下公式計算病毒抑制率。病毒抑制率(%)= (藥物作用組平均OD值-病毒對照組平均OD值)/ (正常細胞組平均OD值-病毒對照組平均OD值)×100%

1.2.6 病毒載量的測定 同上培養(yǎng)RD細胞48 h，根據(jù)CCK8實驗結果顯示，采用兩種作用方式(即病毒感染后給藥、藥物與病毒同時加入)；并根據(jù)“1.2.5”結果設定瑞香素濃度為15、10、7.5、5、2.5 μg/mL)；利用EV71核酸測定試劑盒(Real-time-PCR)檢測病毒載量。循環(huán)設置：45℃ 10 min，95℃ 15 min，再按95℃ 15 s至60℃ 60 s，循環(huán)40次，單點熒光檢測在60℃，反應體系為25 μL。

2 結果

2.1 病毒滴定 TCID50法測定繁殖的EV71病毒滴度，將有病變的孔標記，按公式計算。結果顯示，EV71病毒滴度為10-5.9/0.1 mL，即將EV71病毒稀釋10-5.9倍后接種100 μL可使50%的細胞發(fā)生病變。實驗時采用病毒的濃度為100TCID50。

2.2 瑞香素對RD細胞存活率的影響 不同濃度的瑞香素作用RD細胞72 h，有不同的作用效果。瑞香素濃度為3.125～25 μg/mL時，鏡下細胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變，細胞存活率較正常細胞組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。當瑞香素為20 μg/mL和25 μg/mL時，細胞的存活率分別降至83.55%和65.66%，低于正常細胞組；而瑞香素濃度為30 μg/mL和40 μg/mL時，細胞的存活率分別降至59.00%和48.04%，明顯低于正常細胞組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，瑞香素最大無毒濃度(TC0)為15 μg/mL，通過回歸法計算出TC50為33.47 μg/mL。見表1、圖1。

瑞香素濃度(μg/mL)存活率4048.04±0.02?3059.00±0.01?2565.66±0.022083.55±0.0315106.61±0.0712.5103.81±0.0910106.46±0.067.5108.25±0.116.25108.75±0.015107.16±0.173.125103.50±0.090(正常細胞組)100.00±0.11

*與正常細胞組比較P<0. 05

*與正常細胞組比較 P<0.05，n=4

2.3 瑞香素對病毒EV71 抑制率的影響 采用不同濃度瑞香素作用病毒感染細胞，觀察瑞香素對病毒EV71 抑制率的影響。根據(jù)2.2結果設定瑞香素濃度為15、12.5、10、7.5、5、3.75、2.5、1.875、1.25、1 μg/mL。

2.3.1 病毒感染后加藥 上述濃度瑞香素作用后，對EV71病毒感染均有一定的抑制效果，且呈劑量依賴性。瑞香素濃度為1～3.75 μg/mL時，病毒抑制率在17.58%～34.97%；瑞香素濃度為5～10 μg/mL時，病毒抑制率在55.73%～69.31%，瑞香素濃度為12.5、15 μg/mL時，病毒抑制率為86.39%、82.00%，與正常細胞組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，瑞香素濃度為7.5～15 μg/mL時，而與陽性藥物組(50 μg/mL RVB)比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、圖2-A。

2.3.2 病毒感染時加藥 上述濃度瑞香素和EV71病毒混合培養(yǎng)后，對EV71病毒都有一定的抑制效果。瑞香素濃度為1～10 μg/mL時，其病毒抑制率在11.03%～46.46%之間；而瑞香素濃度為12.5、15 μg/mL的病毒抑制率分別為97.25%、69.06%，與正常細胞組比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。瑞香素濃度為12.5 μg/mL時，與陽性藥物組(50 μg/mL RVB)比病毒抑制率亦明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，瑞香素濃度為3.75～10，15 μg/mL時，與陽性藥物組比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、圖2-B。

藥物濃度(μg/mL)病毒感染后期病毒感染期瑞香素1582.00±0.308 69.06±0.390瑞香素12.586.39±0.20997.25±0.040?瑞香素1069.31±0.25138.56±0.410瑞香素7.562.88±0.13246.46±0.370瑞香素555.73±0.24534.29±0.390瑞香素3.7534.97±0.35238.39±0.270瑞香素2.529.75±0.30321.32±0.300瑞香素1.87527.37±0.40511.03±0.300瑞香素1.2524.00±0.32212.34±0.290瑞香素1 17.58±0.00012.63±0.0000(正常細胞組)100.00±0.227100.00±0.230RVB 5090.10±0.10846.09±0.020

*與陽性藥物組比較P<0.05

A：病毒感染后期；B：病毒感染期；◇與陽性藥物組比較 P<0.05

2.4 瑞香素對病毒載量的影響 采用RT-PCR進一步觀察瑞香素對病毒載量的影響。根據(jù)2.3結果設定瑞香素濃度為15、10、7.5、5、2.5 μg/mL。

2.4.1 病毒感染后加藥 濃度為15、10 μg/mL的瑞香素在EV71病毒感染后用藥對EV71有較好的抑制效果，其病毒載量下降，與病毒對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。見表3、圖3-A。

2.4.2 病毒感染時加藥 濃度為15、10、7.5 μg/mL的瑞香素與EV71病毒混合培養(yǎng)后，對EV71病毒有較好的抑制效果，其病毒載量下降，與病毒對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。見表3、圖3-B。

瑞香素濃度(μg/mL)病毒載量病毒感染后期病毒感染期158.16±0.060△8.20±0.067△108.07±0.060△8.06±0.066△7.58.15±0.0668.14±0.046△58.63±0.0568.34±0.0802.58.53±0.0938.27±0.1940(病毒對照組)8.50±0.0148.445±0.036

△與病毒對照組比較P<0.05

A：病毒感染后期；B病毒感染期；△與病毒對照組比較 P<0.05

3 討論

近些年，以EV71感染為主的HFMD在亞太地區(qū)的發(fā)病率、病死率呈上升趨勢，中國作為人口第一大國，嬰幼兒多，全國多個地點爆發(fā)過HFMD，現(xiàn)已成為國內關注的嚴重公共衛(wèi)生問題。EV71感染的HFMD多是重癥病情，嚴重時可致死。目前EV71感染的致病機制尚不明確，未找到關鍵致病基因，相對臨床應用于治療EV71的相關藥物(免疫球蛋白、RVB和Pleconaril等)在體內只有抗病毒活性，不具備抑制EV71誘導的細胞病變效應。隨著篩選和分離技術的提高，從中草藥中篩選和提取抗 EV71 藥物成分已成為近些年國內研究EV71的治療熱點。傳統(tǒng)的中藥毒副作用小、具有調節(jié)免疫功能、抑制病毒復制和鎮(zhèn)痛抗炎等多重療效，研究意義重大。研究表明，小蘗堿以劑量依賴性抑制EV71的活性，主要是通過下調MRK/ERK信號通路和抑制EV71產生的自噬表達來完成的[5]。袁琦等[20]利用體外實驗CPE法檢測出紅景天甲醇冷浸提取物具有抗EV71病毒的活性。穿心蓮內酯磺酸鹽(喜炎平注射液)通過調節(jié)嗜中性粒細胞和T淋巴細胞的直接免疫調節(jié)活性，提高機體的免疫力，從而保護小鼠免受致死性EV71攻擊[21]。

本實驗室多年來對金邊瑞香及瑞香素進行了系列研究[18-19,22-25]，前期已經證實的瑞香素的抗炎、抗凋亡、抗腫瘤等相關藥理作用，本研究則從另一個角度——“抗病毒”出發(fā)，為瑞香素的藥用價值提供更多的實驗依據(jù)。本實驗成功地進行了病毒EV71擴增與滴定，并用CPE、CCK8、RT-PCR檢測不同濃度的瑞香素對EV71的抑制率，結果顯示：瑞香素對RD細胞的TC50為33.47 μg/mL，TC0為15 μg/mL。選取無毒范圍的瑞香素濃度作用于病毒感染的不同階段，結果表明瑞香素在病毒感染期與感染后期均有不同的抑制效果。病毒感染后加入濃度為12.5、15 μg/mL瑞香素，其病毒抑制率為86.39%、82.00%,顯示其在該濃度下對病毒有很好的抑制作用，且瑞香素濃度為7.5～15 μg/mL時，與陽性藥物組比無顯著性差異，顯示其在較低的濃度下對病毒仍能具有與RVB相似的抑制效果。而在病毒感染期，瑞香素濃度為12.5、15 μg/mL的病毒抑制率分別為97.25%、69.06%，同樣對病毒有很好的抑制作用，且瑞香素濃度為12.5 μg/mL時，與陽性藥物組相比抑制率亦明顯升高，在濃度為低至3.75 μg/mL時，亦能達到與RVB有相似的抑制作用。同時，對這兩階段提取培養(yǎng)液上清進行RT-PCR檢測，濃度為15、10 μg/mL的瑞香素在EV71感染細胞后再用藥處理，能有效降低病毒載量；而以濃度為15、10、7.5 μg/mL瑞香素與EV71病毒混合作用于細胞，同樣具有降低病毒載量的作用，均對EV71的復制有較好的抑制效果。由此可見，瑞香素在體外有明確的抗EV71病毒作用，其結果為進一步研究其藥效提供了有力的實驗依據(jù)。

目前有研究發(fā)現(xiàn)機體免疫調節(jié)是抗EV71治療的另一重要手段，其中巨噬細胞，干擾素(IFN)可均具有較強的抑制病毒作用，通過免疫調節(jié)，增強機體抗病毒免疫應答，降低小鼠病死率的作用[26]。而本實驗室發(fā)現(xiàn)瑞香素具有較好免疫調節(jié)作用，可提高Foxp3+Treg細胞水平，調節(jié)Th17細胞[19]。因此，用瑞香素治療EV71感染為主的HFMD具有較好的開發(fā)前景，可為抗EV71藥物提供了潛在可能性。隨著瑞香素濃度的升高，對EV71的抑制作用逐漸增強，但是當濃度超過一定值時，抑制率也不再上升，可能與瑞香素對RD細胞產生的雙向調節(jié)作用有關。由此可見，瑞香素在體外有明確的抗EV71病毒作用，可望為治療EV71感染的HFMD，以及瑞香素抗病毒分子機制研究提供實驗依據(jù)。