胡亮,羅小金,叢瀟怡,裴元元,魏鳳香
染色體G顯帶核型分析作為一種經(jīng)典的細胞遺傳學(xué)檢測技術(shù),是染色體病診斷的金標準[1-2],在產(chǎn)前診斷、輔助生殖等領(lǐng)域具有重要意義。染色體G顯帶核型制片方法根據(jù)獲得條帶的數(shù)量是否達到550條帶可分為中低分辨染色體制片法和高分辨染色體制片法。高分辨染色體與常規(guī)中低分辨染色體相比,能夠提供更多的染色體結(jié)構(gòu)信息,有著重要的臨床應(yīng)用價值。雖然高分辨染色體制片技術(shù)已較為成熟,并應(yīng)用于臨床,但是對高分辨染色體制片效果進行質(zhì)量評價的方法較少。本研究建立了一種染色體制片條帶水平量化評價方法,并對高分辨染色體制片方法和常規(guī)中低分辨染色體制片法的制片效果進行比較,介紹如下。
1.1 主要試劑 培養(yǎng)基:外周血淋巴細胞培養(yǎng)基:5 mL/瓶,胎牛血清濃度10%(一生駿)。5-氟尿嘧啶:10-5mol/L(Sigma),尿嘧啶核苷:10-5mol/L(sigma),胸腺嘧啶:10-3mol/L(Sigma),溴化乙錠(EB):1 g/L(sigma);秋水仙素:40 ng/μL(Aladdin)。
1.2 樣本采集、接種及培養(yǎng) 隨機選取2016年9月—2017年3月因不良孕史就診并進行染色體核型分析的受檢者233例,其中男99例,女134例,年齡21~45歲,平均(31.2+3.2)歲。抽取其3 mL肘正中靜脈血,并用1 mL注射器接種至2瓶5 mL培養(yǎng)基,每瓶接種0.4 mL,于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。
1.3 細胞周期同步化、收獲及顯帶 培養(yǎng)72 h后,每例受檢者的2瓶培養(yǎng)細胞分別采用中低分辨制片方法和高分辨制片方法進行收獲、顯帶。中低分辨方法:加入秋水仙素(終濃度1.8×10-4g/L),50 min后收獲并顯帶。高分辨方法:加入5-氟尿嘧啶(終濃度1.5×10-7mol/L)和尿嘧啶核苷(終濃度1.5×10-7mol/L),繼續(xù)培養(yǎng)16 h后,加入胸腺嘧啶(終濃度1.5×10-6mol/L)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,加入溴化乙錠(終濃度6×10-3g/L)。45 min后,加入秋水仙素(終濃度2.4×10-4g/L)。40 min后收獲細胞。
收獲及顯帶流程如下。低滲:將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至15 mL離心管,2 000 r/min離心5 min,棄上清,加37℃預(yù)溫的0.075 mol/L KCl 8 mL,吹打混勻后37 ℃水浴25 min;預(yù)固定:加入1 mL 3∶1甲醇冰醋酸固定液,吹打混勻,37℃水浴10 min,2 000 r/min離心5 min;固定:加入8 mL 3∶1甲醇冰醋酸固定液,吹打混勻,2 000 r/min離心5 min,本步驟重復(fù)3次;滴片:40 cm高度滴片,每張玻片滴2滴,70℃干烤2 h。顯帶:將25 mg胰酶粉末溶于37℃預(yù)溫的50 mL生理鹽水,并加入0.5 mL 3%tris溶液。胰酶消化10~20 s,吉姆薩染色1.5 min。上述消化及顯帶條件根據(jù)實際效果隨時調(diào)整。
1.4 核型分析 利用全自動染色體核型分析工作站(Leica GS120)采集各樣本分裂相,每例樣本采集兩種方法所制的玻片各3張,每張玻片隨機采集60個分裂相,共計180個分裂相。若分裂相數(shù)量不足則增加采集玻片數(shù)量,直至采集到的分裂相總數(shù)達到180個。選取各樣本180個分裂相中形態(tài)清晰,長度適中,分散適度的3個分裂相進行核型分析。核型分析標準參照《ISCN2016》。
1.5 質(zhì)量評價條帶的選取 參照《ISCN2016》Fig.5所示的染色體核型示意圖選取15條質(zhì)評條帶。質(zhì)評條帶需滿足3個條件:①均為G顯帶著色較深的深帶,便于辨認;②質(zhì)評條帶在某一條帶分辨水平下可見,而在較低一級的條帶分辨水平下不可見,例如質(zhì)評條帶1p31.3在550條帶水平下可見,在400條帶水平下不可見;③質(zhì)評條帶應(yīng)距離著絲粒、次縊痕等多態(tài)區(qū)較遠,避免多態(tài)影響條帶觀察。質(zhì)評條帶的可見最低分辨以550條帶水平為主,少量選取400及700條帶水平的條帶。
1.6 質(zhì)量評價評分及統(tǒng)計學(xué)方法 對每例樣本的兩種方法獲得的3個核型圖進行質(zhì)量評價。在一個核型圖中,以在任意一條同源染色體中能否清晰可見15個質(zhì)評條帶為標準進行評分,對于每一條質(zhì)評條帶,可見計1分,不可見計0分。合計3個核型圖的總分,滿分為45分,評分越高表明該樣本制片質(zhì)量越高。對同一樣本的核型分析及質(zhì)量評價均由一人獨立完成。所得數(shù)據(jù)用R-3.4.4進行配對樣本雙側(cè)t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 質(zhì)量評價條帶的選取 15條質(zhì)評條帶見表1。
表1 染色體質(zhì)量評價條帶表
2.2 不同制片方法制片效果的質(zhì)量評價 利用15個質(zhì)評條帶對兩種方法所制的染色體核型進行評分,結(jié)果見圖1A。中低分辨方法制備的核型質(zhì)評分數(shù)最低為4分,最高29分,平均為(17.82±4.79)分,高分辨方法制備的核型質(zhì)評分數(shù)最低為6分,最高44分,平均為(26.84±7.70)分。高分辨方法制片質(zhì)量評分高于中低分辨方法,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.161,P=0.000)。各質(zhì)評條帶在兩組染色體核型中的可見核型數(shù)見圖1B。
圖1 不同制片方法效果質(zhì)量評分圖
染色體G顯帶核型分析是目前臨床廣泛應(yīng)用的形態(tài)學(xué)遺傳檢測技術(shù),在現(xiàn)階段尚無法被染色體微陣列分析、二代測序等分子遺傳學(xué)方法完全取代[1]。其中高分辨染色體核型分析由于能夠提供細致的帶紋信息,在部分平衡性染色體結(jié)構(gòu)異常的診斷中仍具有重要意義[2]。傳統(tǒng)的染色體制片過程中對染色體制片效果的評價大多集中于細胞分裂指數(shù)和染色體分散程度[3],主要依賴操作者個人經(jīng)驗,較為主觀,且對帶紋數(shù)量的評價不夠細致,不利于700~850條帶水平下的染色體制片質(zhì)量評價。為此本研究中建立了一套量化的染色體制片質(zhì)量評價方法。該方法利用位于12個染色體上的15條深帶作為質(zhì)量評價條帶并進行評分。通過上述評分,本研究獲得了染色體制片質(zhì)量的量化評價方法,該方法具有相對客觀、精細,不同批次、操作者、實驗室間易于比較的優(yōu)點,能夠更好地對染色體制片環(huán)節(jié)進行質(zhì)量控制以及技術(shù)優(yōu)化。
本研究結(jié)果顯示,高分辨方法的評分高于中低分辨率方法。高分辨方法的核型帶紋水平顯著高于中低分辨方法。高分辨方法中少量樣本的評分較低,接近或低于中低分辨方法的評分均值,這是由于高分辨染色體制片的條件要求較苛刻,部分樣本收獲效果欠佳所致。
本研究中質(zhì)評條帶的選取兼顧了評價方法的便捷性與客觀性。選取的條帶均為深帶,且距多態(tài)區(qū)域較遠,易于觀察。在15個質(zhì)評條帶中,400條帶水平可見的條帶3個,550條帶水平可見的條帶9個,700條帶水平可見的條帶3個。400條帶水平的質(zhì)評條帶6q14、14q12、17q22在兩組大部分核型中均可見,且可見的核型數(shù)兩組間均無差異;550條帶水平的質(zhì)評條帶在兩組間的可見核型數(shù)有差異;700條帶水平的質(zhì)評條帶9q31.3、16q23.1、17q23.2主要僅見于高分辨組,提示核型條帶數(shù)達到700~850水平。本研究中質(zhì)評條帶的評價目標為目前臨床上高分辨染色體較為常用的550~700條帶水平,兼顧400~550以及700~850條帶水平。但對于400條帶以下和850條帶以上的核型不具有評價價值。
染色體核型分析的質(zhì)量評價是細胞遺傳工作中的重點和難點[4-5]。由于高分辨染色體的制片過程較為復(fù)雜,對制片條件進行優(yōu)化改善顯得尤為必要。本研究建立的上述染色體制片質(zhì)量評價標準,能夠評價400~700條帶水平的常規(guī)中低分辨染色體及高分辨染色體,具有操作方便,簡單易用的特點。將染色體核型質(zhì)量評價量化分析后,可為優(yōu)化條件,提高制片質(zhì)量提供依據(jù)。此外,本評價方法相對客觀,有利于實驗室開展室內(nèi)質(zhì)量控制以及室間質(zhì)量評價,進一步改善染色體制片質(zhì)量。