兩種抽吸模式下不同圓周卷煙主流煙氣釋放物及毒理學分析

羅彥波，龐永強，姜興益，付亞寧，張洪非，李翔宇，朱風鵬，陳 歡

國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

卷煙的圓周會影響抽吸過程中煙氣的形成和遞送［1-2］。有研究表明，卷煙主流煙氣焦油、煙堿和一氧化碳釋放量隨著圓周的減小而線性降低［3-4］。近年來細支卷煙（煙支直徑為17.0±1.0 mm）等小圓周卷煙的產(chǎn)銷量持續(xù)上升。與常規(guī)卷煙相比，小圓周卷煙具有焦油和有害成分釋放量低、直徑小、長度大和吸阻高等特點［5-6］。隨著全球控煙履約工作的深入開展，細支卷煙已受到廣泛的關注［7］。因此，研究不同圓周卷煙的主流煙氣釋放物及煙氣毒理學特征對細支卷煙產(chǎn)品設計和質量監(jiān)控具有重要意義。

目前，國內在細支卷煙的制造工藝及品質穩(wěn)定性方面已有較多的研究報道［8-11］。甘學文等［12］研究了加拿大深度抽吸（HCI）模式下細支卷煙煙氣常規(guī)指標的釋放特點；田忠等［9］研究了制絲關鍵工序對細支卷煙主流煙氣常規(guī)指標、有害成分及致香成分的影響；葛暢等［6］比較了細支卷煙與常規(guī)卷煙煙氣指標的釋放量差異；邊照陽等［5］考察了市售細支卷煙的主流煙氣有害成分釋放量情況。有關細支卷煙煙氣毒理學評價方面的研究報道較少，Coggins等［13］研究了煙支圓周對煙氣體外毒理學評價結果的影響，但該研究中使用的細支卷煙不含濾嘴，與當前市售產(chǎn)品差異較大。另外，研究卷煙主流煙氣常規(guī)指標的逐口釋放量有助于了解卷煙的燃吸過程及焦油、煙堿的遞送規(guī)律，可為卷煙產(chǎn)品設計及質量控制提供參考［14］。為此，制作3種葉組配方相同的細支、中支和常規(guī)卷煙，分析ISO和HCI抽吸模式下的卷煙主流煙氣常規(guī)指標和有害成分（以煙氣危害性評價指數(shù)H表示），評價卷煙煙氣體外毒理學特征，并考察卷煙主流煙氣常規(guī)指標的逐口釋放規(guī)律，旨在了解不同圓周卷煙主流煙氣成分的釋放特征和毒理學差異，為適應WHO對細支卷煙的管控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

由相同烤煙型葉絲制作的不同圓周（24、20和17 mm）卷煙（福建中煙工業(yè)有限責任公司廈門卷煙廠提供）；中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞（中國科學院細胞庫）；鼠傷寒沙門氏菌TA98（中國軍事醫(yī)學科學院提供）；大鼠S9活化系統(tǒng)（美國Moltox公司）。

煙堿（≥98.5%，國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心）；一氧化碳標準氣體（國家標準氣體研究中心）；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）；氰化氫溶液標準物質（58 μg/mL，中國計量科學研究院）；銨離子溶液標準物質（1 000 μg/mL，國家標準物質中心）；4-（甲基亞硝氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK，≥97%，加拿大Toronto公司）；液氮、氦氣、氮氣和氬氣（99.999%，河南科益氣體股份有限公司）；乙腈、甲醇和環(huán)己烷（色譜純，德國Merck公司）；巴豆醛、苯酚和苯并［a］芘（B［a］P，≥99%），醋酸、乙酸銨和二甲亞砜（色譜純），十二烷基硫酸鈉（99%），環(huán)磷酰胺（97%），2-氨基芴（98%）（美國Sigma公司）。

CP224S電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius公司）；SM450型20通道吸煙機（英國Cerulean公司）；RM200A和RM20H轉盤型吸煙機， 92和 44 mm劍橋濾片（德國Borgwaldt-KC公司）；Agilent 7890A氣相色譜儀（配火焰離子化檢測器）、Agilent 1200高效液相色譜儀（配紫外檢測器）、Agilent7890-5975氣質聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；AA3連續(xù)流動分析儀（德國Bran+Luebbe公司）；IC3000離子色譜儀（美國Dionex公司）；Waters e2695高效液相色譜儀（配熒光檢測器，美國Waters公司）；API 4000三重四極桿質譜儀（美國AB公司）；J-II全自動定量濃縮儀（北京普立泰科儀器有限公司）；Q-POD Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；96孔板（美國Corning公司）；底層培養(yǎng)基（1.8%瓊脂粉、2.0%葡萄糖和2.0%磷酸鹽溶液）、頂層培養(yǎng)基（0.6%瓊脂粉、0.5%NaCl溶液和0.5 mmol/L組氨酸-0.5 mmol/L生物素溶液）（北京陸橋技術股份有限公司）；0.45 μm水相和有機相濾頭（上海安譜科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 卷煙物理指標的測定

按照 GB/T 5606.1—2004［15］進行取樣并隨機分組，每組30支。將卷煙樣品按照GB/T 16447—2004［16］的方法于溫度（22±1）℃和相對濕度（60±2）%的環(huán)境中平衡48 h。依據(jù)GB/T 22838.2—2009［17］、GB/T 22838.3—2009［18］、GB/T 22838.4—2009［19］和 GB/T 22838.15—2009［20］的方法分別測試長度、圓周、質量和通風率。

1.2.2 卷煙主流煙氣化學指標的分析

（1）煙氣化學指標釋放量及H指數(shù)分析。按照 GB/T 16447—2004［16］的方法將卷煙樣品于溫度（22±1）℃和相對濕度（60±2）%的環(huán)境中平衡48 h［16］。依據(jù) GB/T 19609—2004［21］、GB/T 23355—2009［22］、GB/T 23356—2009［23］、YC/T 253—2008［24］、YC/T 377—2010［25］、YC/T 254—2008［26］、YC/T 255—2008［27］、GB/T 21130—2007［28］和 YQ/T 17—2012［29］的方法分別分析ISO和HCI抽吸模式下主流煙氣中總粒相物（TPM）和焦油、煙堿、CO、HCN、NH3、巴豆醛、苯酚、B［a］P和 NNK 的釋放量。由上述指標計算卷煙主流煙氣H指數(shù)［30］。

（2）煙氣常規(guī)指標逐口釋放量分析。用RM20H轉盤型吸煙機在ISO抽吸模式下抽吸卷煙。每輪抽吸20支卷煙，將每輪同一口序的煙氣TPM捕集在同一張劍橋濾片上，分析后得到不同圓周卷煙主流煙氣常規(guī)指標的逐口釋放量。

1.2.3 卷煙主流煙氣毒理學指標的評價

女孩的身體還非常虛弱，但她仍然幫著青辰將天葬師背回了屋中。天葬師昏迷著，心口的刀傷已經(jīng)不再有鮮血流出，好似他的整個身體的血液，都已經(jīng)干涸。

分別在ISO和HCI抽吸模式下抽吸卷煙，用92 mm劍橋濾片捕集卷煙主流煙氣TPM，并用二甲亞砜萃取TPM，得到質量濃度為10 mg/mL的主流煙氣TPM萃取溶液，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆?。實驗時，將其稀釋到實驗設計濃度。依據(jù)YQ/T 42—2013［31］、YQ 4—2011［32］和 YQ 3—2011［33］的方法分別評價卷煙煙氣的細胞毒性、體外微核率和致突變性。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS18.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，通過單因素方差分析和多重比較、配對t檢驗對不同樣品進行統(tǒng)計學差異檢驗，并判定P＜0.05時具有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 卷煙常規(guī)物理指標分析結果

3種卷煙樣品的物理指標如表1所示。由表1可以看出，中支卷煙和細支卷煙的長度大于常規(guī)卷煙；吸阻和總通風率均隨卷煙圓周的增大而降低；中支卷煙和細支卷煙的濾嘴通風率相當，且都顯著高于常規(guī)卷煙；煙絲質量則隨著卷煙圓周的增大而增加。

表1 3種卷煙樣品物理指標Tab.1 Physical indexes of 3 cigarette samples

2.2 卷煙主流煙氣化學指標分析結果

3種卷煙樣品在ISO和HCI抽吸模式下的煙堿及7種有害成分釋放量如表2所示。由表2可以看出，隨著卷煙圓周的減小，卷煙主流煙氣化學指標的釋放量逐漸降低，這主要是由煙絲量減少所致。為了客觀地比較不同圓周卷煙主流煙氣化學指標的釋放量，本研究中采用WHO推薦的單位煙堿釋放量（mg/mg煙堿）方式［34］進一步比較了圓周對卷煙主流煙氣常規(guī)煙氣指標及H指數(shù)的影響。

3種卷煙樣品的煙堿釋放量、常規(guī)煙氣指標單位煙堿釋放量及H指數(shù)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果如表3所示。由表3可以看出，在ISO抽吸模式下，3種卷煙樣品之間存在顯著性差異（P＜0.05）。在HCI抽吸模式下，常規(guī)卷煙與中支和細支卷煙之間存在顯著性差異（P＜0.05）；細支卷煙與中支卷煙僅煙堿釋放量和單位煙堿H指數(shù)之間存在顯著性差異（P＜0.05）。

表3 2種抽吸模式下3種卷煙樣品的單因素方差分析和多重比較結果①Tab.3 Results of single-factor analysis of variance and multiple comparisons of 3 cigarette samples under two smoking regimes

圖1 ISO抽吸模式下3種卷煙常規(guī)煙氣指標和有害成分（以H指數(shù)表示）的單位煙堿釋放量Fig.1 Routine smoke indexes and 7 harmful components（expressed as H index）per unit nicotine yield of 3 cigarette samples under ISO smoking regime

圖2 為HCI抽吸模式下3種卷煙主流煙氣常規(guī)指標的單位煙堿釋放量及H指數(shù)?？梢?，卷煙主流煙氣7種有害成分（以H指數(shù)表示）的單位煙堿釋放量隨著圓周的減小呈降低趨勢；而TPM、水分和焦油的單位煙堿釋放量均呈現(xiàn)中支卷煙>細支卷煙>常規(guī)卷煙的趨勢。這可能是由于細支卷煙參與燃燒的煙絲量明顯少于中支和常規(guī)卷煙（經(jīng)計算，3種卷煙參與燃燒的煙絲體積比為細支卷煙∶中支卷煙∶常規(guī)卷煙=1.00∶1.38∶1.48），且中支卷煙的煙堿釋放量低于常規(guī)卷煙。通過比較2種抽吸模式下的釋放量，發(fā)現(xiàn)HCI抽吸模式下主流煙氣水分的單位煙堿釋放量顯著高于ISO抽吸模式。

圖2 HCI抽吸模式下3種卷煙常規(guī)煙氣指標和有害成分（以H指數(shù)表示）的單位煙堿釋放量Fig.2 Routine smoke indexes and 7 harmful components（expressed as H index） per unit nicotine yield of 3 cigarette samples under HCI smoking regime

2.3 卷煙主流煙氣毒理學評價結果

2.3.1 細胞毒性測試結果

基于單位TPM計算的卷煙煙氣體外細胞毒性測試結果如表4所示?？梢钥闯?，在ISO抽吸模式下，體外細胞毒性呈現(xiàn)常規(guī)卷煙>細支卷煙≈中支卷煙的趨勢；在HCI抽吸模式下，體外細胞毒性呈現(xiàn)中支卷煙≈常規(guī)卷煙>細支卷煙的趨勢。說明在2種抽吸模式下，卷煙煙氣體外細胞毒性整體上隨著煙支圓周的減小而下降。對于相同圓周卷煙，HCI抽吸模式下的IC50值均略高于ISO抽吸模式，這與文獻［13，35］報道的結果一致。

2.3.2 體外微核試驗結果

基于單位TPM計算的卷煙煙氣體外微核測試結果如表5所示?？梢钥闯?，與空白對照相比，所有樣品的微核率均顯著增加，并呈現(xiàn)劑量-反應關系，表明所有卷煙主流煙氣TPM均存在一定的遺傳毒性。

2.3.3 致突變性試驗結果

基于單位TPM計算的卷煙煙氣Ames試驗結果如表6所示?？梢钥闯?，在較高的TPM濃度下，3種卷煙主流煙氣均使TA98的回復突變菌落比值（回復突變菌落數(shù)/自發(fā)回復突變菌落數(shù)，MR）≥2，且呈劑量依賴關系，說明所有受試煙氣TPM均具有一定致突變性。

表4 3種卷煙主流煙氣TPM的細胞抑制率和IC50值Tab.4 Cell inhibition rate and IC50value for TPM of mainstream smoke of 3 cigarette samples （%）

表5 3種卷煙主流煙氣TPM的體外微核測試結果Tab.5 Results of in vitro micronucleus assay for TPM of mainstream smoke of 3 cigarette samples （%）

表63 種卷煙主流煙氣TPM的Ames試驗結果Tab.6 Results of Ames test for TPM of mainstream smoke of 3 cigarette samples

對2種抽吸模式下不同圓周卷煙主流煙氣的毒理學數(shù)據(jù)進行配對t檢驗，結果如表7所示?？梢钥闯?，ISO抽吸模式下，常規(guī)卷煙與中支和細支卷煙煙氣細胞毒性數(shù)據(jù)的P值均小于0.05，說明具有顯著性差異，常規(guī)卷煙的細胞毒性最高。HCI抽吸模式下，中支卷煙與細支卷煙煙氣細胞毒性數(shù)據(jù)的P值小于0.05，說明具有顯著性差異，且中支卷煙煙氣的細胞毒性高于細支卷煙。不同圓周卷煙主流煙氣的體外微核率和致突變性試驗數(shù)據(jù)的P值均大于0.05，說明無顯著性差異。

表7 2種抽吸模式下3種卷煙樣品的毒理學數(shù)據(jù)配對t檢驗結果①Tab.7 Paired-t test results of in vitro toxicology data of 3 cigarette samples under two smoking regimes

2.4 常規(guī)煙氣指標的逐口釋放量變化

ISO抽吸模式下不同圓周卷煙主流煙氣常規(guī)指標的逐口釋放量如圖3所示?？梢钥闯?，細支卷煙的抽吸口數(shù)較少。卷煙抽吸過程中，第1口（點燃抽吸）和最后1口（終止抽吸）的煙氣釋放量與其他口之間存在較大差異。第1口的差異主要來源于卷煙點燃過程，最后1口的差異主要是因為抽吸不完全［36］。不同圓周卷煙主流煙氣常規(guī)指標的逐口釋放量基本上呈現(xiàn)隨抽吸口數(shù)的增加而增加的趨勢，這可能是由于卷煙燃燒使煙支長度不斷減小，導致未燃燒煙絲和濾嘴的過濾效果變差。

圖3 3種卷煙樣品常規(guī)煙氣指標的逐口釋放量Fig.3 Puff-by-puff releases of routine smoke indexes of 3 cigarette samples

3 結論

①ISO抽吸模式下，中支卷煙主流煙氣常規(guī)指標的單位煙堿釋放量和H指數(shù)最低；HCI抽吸模式下，不同圓周卷煙主流煙氣單位煙堿H指數(shù)隨著圓周的降低而下降。②卷煙煙氣體外細胞毒性整體上隨著煙支圓周的減小而下降，不同圓周卷煙煙氣TPM的遺傳毒性和致突變性無顯著性差異。③不同圓周卷煙主流煙氣常規(guī)指標的逐口釋放量整體上呈現(xiàn)隨抽吸口數(shù)增加而增加的趨勢。