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    洛陽(yáng)煙區(qū)煙株根圍抗煙草疫霉放線菌的篩選與鑒定

    2019-01-25 03:18:18陳奇園丁鑰琪趙世民李淑君康業(yè)斌
    煙草科技 2019年1期
    關(guān)鍵詞:放線菌瓊脂菌絲

    陳奇園,丁鑰琪,趙世民,李淑君,康業(yè)斌*

    1.河南科技大學(xué)林學(xué)院,河南省洛陽(yáng)市開元大道263號(hào) 471023

    2.河南省煙草公司洛陽(yáng)市公司,河南省洛陽(yáng)市開元大道246號(hào) 471023

    3.河南省農(nóng)科院許昌煙草研究所,河南省許昌市魏都區(qū)永昌大道 461000

    由煙草疫霉(Phytophthora parasitica var.nicotianae)侵染煙草引起的黑脛病是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的毀滅性土傳真菌病害[1]。目前,煙草黑脛病的防治措施主要采用種植抗病品種、合理輪作與藥劑防治。然而,隨著煙草栽培制度的改變,抗病品種連年、大面積單一種植,極易導(dǎo)致其抗病性喪失。生產(chǎn)上常用的甲霜靈等幾種內(nèi)吸性殺菌劑對(duì)煙草疫霉作用位點(diǎn)單一,容易產(chǎn)生抗藥性而引起藥效下降,從而導(dǎo)致藥劑用量加大,使煙葉中的農(nóng)藥殘留增加、造成環(huán)境污染[2-4]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼開展了拮抗放線菌防治煙草病害的研究。Lukic等[5]從煙田土壤中分離出28株放線菌,其中兩株對(duì)12種煙草病原真菌有拮抗作用;Kortemaa等[6]報(bào)道了世界上已廣泛應(yīng)用的一種放線菌的活體制劑防治腐霉菌、疫霉菌、鐮刀菌和絲核菌等常見的土傳病原菌;Loqman等[7]從摩洛哥葡萄根際土壤中分離獲得142株放線菌,并測(cè)定了對(duì)尖孢鐮刀菌、終極腐霉、大麗輪枝菌、灰葡萄孢菌及白絹病菌的拮抗作用,其中有24株放線菌至少抗4種病原菌。周喜新等[8]從湖南長(zhǎng)沙瀏陽(yáng)市北盛鎮(zhèn)煙草黑脛病發(fā)病田健株根際土壤中分離純化獲得1株對(duì)煙草疫霉具有顯著拮抗作用的放線菌LY18,其發(fā)酵液對(duì)煙草疫霉菌絲的抑制率達(dá)70%;王靜等[9]從山東省日照市五蓮縣于里鎮(zhèn)煙田健株根際土壤分離純化獲得1株拮抗放線菌F8,室內(nèi)測(cè)定對(duì)供試煙草疫霉具有較強(qiáng)的抑制作用,溫室盆栽試驗(yàn)防效為70.3%。但河南省煙田土壤中拮抗放線菌種類及開發(fā)應(yīng)用尚未見系統(tǒng)研究報(bào)道,為此,進(jìn)行了洛陽(yáng)地區(qū)煙草根圍土壤中拮抗放線菌的篩選與鑒定,旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用拮抗微生物提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    煙 草 疫 霉(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)以及從煙草根圍土壤分離的放線菌稀釋涂布平板均由河南科技大學(xué)植物病害分子鑒定與綠色防控實(shí)驗(yàn)室保存。

    試驗(yàn)所用培養(yǎng)基包括:高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、大豆酵母培養(yǎng)基、淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基、蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基、克氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基和葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基。細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒(編號(hào):B518255)和 PCR擴(kuò)增試劑盒(編號(hào):B532491)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 根圍放線菌的純化

    將高氏一號(hào)培養(yǎng)基融化,待冷卻至50℃左右,加入3%的重鉻酸鉀溶液使培養(yǎng)基中重鉻酸鉀濃度約100 mg/L,倒平板;待平板凝固后備用,用滅菌牙簽從前期試驗(yàn)保存的稀釋涂布平板上挑出菌落形態(tài)或顏色不同的放線菌單菌落至高氏一號(hào)平板上劃線分離、純化培養(yǎng)[10],直至獲得單菌落。

    1.2.2 拮抗菌株的篩選

    1.2.2.1 拮抗菌株的初篩

    采用改良的平板對(duì)峙培養(yǎng)法[11]測(cè)定菌株對(duì)煙草疫霉的拮抗作用,保留抑菌率≥50%的菌株進(jìn)行復(fù)選。

    1.2.2.2 拮抗菌株的復(fù)篩

    采用菌絲生長(zhǎng)速率法[12]測(cè)定初選菌株發(fā)酵液對(duì)煙草疫霉的抑菌活性,選取抑菌率達(dá)100%的菌株進(jìn)一步鑒定其種類。

    1.2.3 拮抗菌株的鑒定

    1.2.3.1 形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察

    用插片法[13]在普通光學(xué)顯微鏡(無(wú)錫瀚光光學(xué)科技有限公司)100倍油鏡下觀察記載其基內(nèi)菌絲體有無(wú)橫隔、是否斷裂;氣生菌絲體的特征;孢子鏈的形狀、著生方式;孢子的形狀等。

    根據(jù)《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[14],將菌株分別接種在高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基、蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基、克氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基上,28℃下培養(yǎng),分別在7、14、28 d后觀察菌株在不同培養(yǎng)基上氣生菌絲、基內(nèi)菌絲的生長(zhǎng)狀況,是否有可溶性色素產(chǎn)生及其顏色。

    1.2.3.2 生理生化特征觀察

    參照《植病研究法》[12]和《放線菌的分類和鑒定》[15]進(jìn)行明膠液化、牛奶凝固和胨化、淀粉分解、纖維素水解、硫化氫與黑色素產(chǎn)生以及利用碳源產(chǎn)酸等試驗(yàn),觀察生理生化特征。

    1.2.3.3 16S rDNA序列分析

    按照細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒(編號(hào):B518255)說(shuō)明書進(jìn)行放線菌DNA的提取。以提取的DNA為模板,采用通用引物為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′對(duì)放線菌16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL):模板DNA 1.0 μL,10×Taq Buffer(NH4+)5.0 μL,dNTP Mix(10.0 mmol/L)1.0 μL ,Taq DNA Polymerase(5 U/μL)0.25 μL,MgCl2(25 mmol/L)3.0 μL,上下游引物(10.0 μmol/L)各 1.0 μL,加 dd H2O 補(bǔ)至 50 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性1 min,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min,4℃保存。檢測(cè)到合適的條帶后,將其所對(duì)應(yīng)的原始擴(kuò)增產(chǎn)物(未純化,45 μL)由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序得到的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì),用MEGA.6軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 根圍放線菌的純化

    共挑出放線菌單菌落496個(gè),進(jìn)一步分離純化獲得形態(tài)或顏色不同的放線菌單菌落227個(gè)。

    2.2 拮抗菌株的篩選

    2.2.1 拮抗菌株的初篩

    表1顯示,有45株放線菌對(duì)煙草疫霉的抑菌率大于50%,其中25株的抑菌率大于70%。

    表1 放線菌對(duì)煙草疫霉的抑制作用①Tab.1 Inhibition effects of actinomycetes against P.parasitica

    2.2.2 拮抗菌株的復(fù)篩

    表2表明,15株拮抗放線菌的發(fā)酵液對(duì)煙草疫霉的抑菌率大于50%。其中,菌株YY75、YY124、LN204、LN221、LN247、SX92、YY135 和SX59的抑菌率達(dá)100%,確定為優(yōu)勢(shì)拮抗菌株。

    2.3 優(yōu)勢(shì)拮抗菌株的鑒定

    2.3.1 形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察

    菌株YY75孢子絲彎曲,孢子圓形;菌株LN204、LN221和LN247孢子絲螺旋形,孢子圓柱狀;菌株SX92孢子絲波曲,孢子桿狀;菌株YY124和YY135孢子絲圈卷,孢子桿狀;菌株SX59孢子絲螺旋形,孢子桿狀(圖1)。

    表2 拮抗放線菌對(duì)煙草疫霉的抑制作用Tab.2 Inhibition effects of antagonistic actinomycetes against P.parasitica

    在高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基上,菌株YY75氣生菌絲白色,基內(nèi)菌絲乳脂色至紫紅色,無(wú)可溶性色素;菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲白至灰色,基內(nèi)菌絲蜜黃色,無(wú)可溶性色素;菌株SX92氣生菌絲白色,基內(nèi)菌絲乳脂色,無(wú)可溶性色素;菌株YY124和YY135氣生菌絲白色至粉紅色,基內(nèi)菌絲紫紅色,無(wú)可溶性色素;菌株SX59氣生菌絲白色至粉紅色,基內(nèi)菌絲紫紅色,無(wú)可溶性色素。

    在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,菌株YY75氣生菌絲白色,基內(nèi)菌絲乳脂色至褐色,可溶性色素黃色;菌株LN204、LN221和LN204少量灰色氣生菌絲,基內(nèi)菌絲米黃色,無(wú)可溶性色素;菌株SX92氣生菌絲白色,基內(nèi)菌絲褐綠至橄欖灰綠色,可溶性色素墨綠色;菌株YY124和YY135無(wú)氣生菌絲,基內(nèi)菌絲紫紅色,無(wú)可溶性色素;菌株SX59氣生菌絲粉紅色,基內(nèi)菌絲紫紅色,可溶性色素米色。

    在淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基上,菌株YY75無(wú)氣生菌絲,基內(nèi)菌絲米綠色,無(wú)可溶性色素;菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲白至鼠灰色,基內(nèi)菌絲微褐,無(wú)可溶性色素;菌株SX92無(wú)氣生菌絲,基內(nèi)菌絲米綠色,無(wú)可溶性色素;菌株YY124和YY135氣生菌絲粉紅至石南紫,基內(nèi)菌絲玫瑰色至紫紅色,無(wú)可溶性色素;SX59氣生菌絲古粉紅色,基內(nèi)菌絲玫瑰色至信號(hào)紅,無(wú)可溶性色素。

    在蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基上,菌株YY75無(wú)氣生菌絲,基內(nèi)菌絲乳脂色至米綠色,無(wú)可溶性色素;菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲沙紫灰至暗灰色,基內(nèi)菌絲淺灰至灰黃色,無(wú)可溶性色素;菌株SX92氣生菌絲白色,基內(nèi)菌絲硫磺色,可溶性色素黃色;菌株YY124和YY135氣生菌絲白色至粉紅色,基內(nèi)菌絲橘紅至寶石紅,無(wú)可溶性色素;菌株SX59氣生菌絲白色至粉紅色,基內(nèi)菌絲橘紅至寶石紅,無(wú)可溶性色素。

    在葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基上,菌株YY75無(wú)氣生菌絲,基內(nèi)菌絲乳脂色至紫紅色,無(wú)可溶性色素;菌株LN204、LN221和LN204無(wú)氣生菌絲,基內(nèi)菌絲無(wú)色至微黃,無(wú)可溶性色素;菌株SX92無(wú)氣生菌絲,基內(nèi)菌絲乳脂色,無(wú)可溶性色素;菌株YY124和YY135氣生菌絲白色,基內(nèi)菌絲石南紫至酒紅紫,無(wú)可溶性色素;菌株SX59氣生菌絲白色,基內(nèi)菌絲酒紅紫,無(wú)可溶性色素。

    圖1 菌株的孢子絲和孢子形態(tài)(×100)Fig.1 Spore chains and spore morphology of antagonistic strains(×100)

    在克氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基上,菌株YY75氣生菌絲白色,基內(nèi)菌絲乳脂色至葡萄酒紅,無(wú)可溶性色素;菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲淺黃色至灰色,基內(nèi)菌絲蜜黃色,無(wú)可溶性色素;菌株SX92氣生菌絲白色,基內(nèi)菌絲乳脂色,無(wú)可溶性色素;菌株YY124和YY135氣生菌絲粉紅至古粉紅色,基內(nèi)菌絲粉紅至紫紅色,無(wú)可溶性色素;菌株SX59氣生菌絲白色至粉紅色,基內(nèi)菌絲粉紅至橘紅,無(wú)可溶性色素。

    在葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基上,菌株YY75無(wú)氣生菌絲,基內(nèi)菌絲為象牙色至赭黃色,可溶性色素為黃棕色;菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲為白至灰色,基內(nèi)菌絲米為褐色,無(wú)可溶性色素;菌株SX92氣生菌絲為白色,基內(nèi)菌絲為米褐色,可溶性色素為棕色;菌株YY124和YY135氣生菌絲為白色,基內(nèi)菌絲為象牙色至火焰紅,無(wú)可溶性色素;菌株SX59氣生菌絲為粉紅色,基內(nèi)菌絲也為粉紅色,無(wú)可溶性色素。

    2.3.2 生理生化特性

    優(yōu)勢(shì)拮抗菌株均可利用葡萄糖、麥芽糖、阿拉伯糖和甘露醇等多種碳源,明膠液化、纖維素水解均為陽(yáng)性,而硫化氫的產(chǎn)生均為陰性;菌株YY135對(duì)牛奶的凝固和胨化反應(yīng)為陽(yáng)性;菌株YY75和SX92黑色素的產(chǎn)生反應(yīng)也為陽(yáng)性,見表3。

    表3 優(yōu)勢(shì)拮抗菌株的生理生化特征①Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of dominant antagonistic strains

    2.3.3 16S rDNA序列分析

    將菌株LN204、LN221、LN247、SX59、YY124、YY135、YY75和SX92的16S rDNA序列提交至NCBI,登 錄 號(hào) 分 別 為 MH265958、MH265959、MH265960、MH265965、MH265966、MH265967、MH265968和MH265970。進(jìn)一步對(duì)8個(gè)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì),用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果表明,菌株YY75的序列與登錄號(hào)為NR043827(Streptomyces lucensis)等序列同源性大于99%,菌株YY124和YY135的序列與登錄號(hào)為AB184370(S.nobilis)等序列同源性大于99%,菌株LN204、LN221和LN247的序列與登錄號(hào)為JX284411(S.rochei)等序列同源性大于99%,菌株SX92的序列與登錄號(hào)為AB184197(S.coralus)等序列同源性大于99%,菌株SX59的序列與登錄號(hào)為 AB249919(S.aureoverticillatus)等序列同源性大于99%。

    3 討論

    本試驗(yàn)中鑒定的8株優(yōu)勢(shì)拮抗放線菌均屬于鏈霉菌屬,這與邊傳紅[17]從洛陽(yáng)煙草根際土壤中篩選鑒定的13株拮抗放線菌也均屬于鏈霉菌屬的結(jié)果一致;也與廖振林等[18]從廣西北海紅樹林土壤中篩選鑒定的10株拮抗放線菌,其中有8株屬于鏈霉菌屬的結(jié)果一致。說(shuō)明鏈霉菌屬是土壤放線菌中常見的屬。本試驗(yàn)中獲得的優(yōu)勢(shì)拮抗放線菌發(fā)酵液對(duì)煙草疫霉抑制率均達(dá)100%,說(shuō)明發(fā)酵液中含有抑菌活性成分,這與Singh等[19]發(fā)現(xiàn)的S.lucensis可以產(chǎn)生魯薩霉素C和Anukool等[20]發(fā)現(xiàn)的S.rochei F20可以產(chǎn)生抗生素Streptothricin的試驗(yàn)結(jié)果一致,說(shuō)明鏈霉菌屬是放線菌中主要產(chǎn)抗生素的屬。但有關(guān)鏈霉菌屬發(fā)酵液中活性成分分析、抑菌機(jī)理的研究以及盆栽防效試驗(yàn)與田間防治效果等仍有待進(jìn)一步的深入研究。

    圖2 優(yōu)勢(shì)拮抗菌株16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of dominant antagonistic strains based on 16S rDNA sequences

    4 結(jié)論

    從洛陽(yáng)煙區(qū)煙株根圍土壤中分離純化共獲得227個(gè)放線菌單菌落,其中8株的發(fā)酵液對(duì)煙草疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)100%,被確定為優(yōu)勢(shì)拮抗放線菌。根據(jù)這些菌株的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化反應(yīng)和16S rDNA序列分析結(jié)果,菌株YY75鑒定為魯薩鏈霉菌(S.lucensis),菌株YY124和YY135鑒定為高貴鏈霉菌(S.nobilis),菌株LN204、LN221和LN247鑒定為婁徹鏈霉菌(S.rochei),菌株SX92鑒定為珊瑚鏈霉菌(S.coralus),菌株SX59鑒定為金黃回旋鏈霉(S.aureoverticillatus),均屬于放線菌門、放線菌綱、鏈霉菌目、鏈霉菌科、鏈霉菌屬。

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