HBV前C區(qū)A1896基因突變的探討及臨床用藥研究

王 涵，郭志鋼

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外科，長(zhǎng)春 130033）

乙型肝炎由乙肝病毒（HBV）引起，屬于嗜肝病毒，這種病毒喜歡在肝臟中生存，或者說(shuō)肝臟適合它生存下來(lái)，并“繁衍后代”，有的專家形象地稱乙肝病毒為“肝細(xì)胞的寄生蟲”。乙型肝炎病毒（HBV）是一種很小的病毒，它屬于嗜肝脫氧核糖核酸（DNA）病毒組中的一個(gè)成員。病毒顆粒由外膜和內(nèi)核兩部分組成，完整的HBV顆粒是直徑42 nm的球形顆粒，其外膜厚7 nm，由蛋白質(zhì)和膜脂質(zhì)組成，稱作乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。由于其最早在澳大利亞發(fā)現(xiàn)，所以曾被稱為“澳大利亞抗原”，簡(jiǎn)稱“澳抗”。中心部分的直徑約28 nm，為病毒的核心，其中包括核心抗原（HBcAg）和e抗原（HBeAg），內(nèi)核中心含有病毒基因（DNA）和DNA多聚酶。慢性乙型肝炎是指乙肝病毒檢測(cè)為陽(yáng)性，病程時(shí)間較長(zhǎng)或有慢性肝炎表現(xiàn)者。根據(jù)乙肝病毒e抗原分為乙肝病毒e抗原陽(yáng)性和乙肝病毒e抗原陰性的慢性乙型肝炎。近年來(lái)臨床上越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)乙肝病毒e抗原陰性的慢性乙型肝炎患者乙肝病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）載量很高。HBV-DNA即是乙肝病毒的脫氧核糖核酸,其兩鏈長(zhǎng)短不一，長(zhǎng)鏈（L）完整，為負(fù)鏈，長(zhǎng)度恒定，約3 200個(gè)核苷酸。短鏈（S）為正鏈，長(zhǎng)度可變，約為長(zhǎng)鏈長(zhǎng)度的50～100%，鏈的增生按5′-3′順序進(jìn)行。在不同分子中短鏈3′端的位置是可變的，而短鏈和長(zhǎng)鏈的5′端位置固定點(diǎn)為粘性末端，通過(guò)250～300個(gè)核苷酸堿基配對(duì)，以維持DNA分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在粘性末端兩側(cè)，兩鏈5′端各有一個(gè)由11個(gè)bp組成的直接重復(fù)序列（Direct repeat DR）-5′TTCACCTCTCC，該DR位于第1824個(gè)核苷酸者稱DR1，位于第1590個(gè)核苷酸者稱DR2，在病毒復(fù)制中起作用，HBV-DNA陽(yáng)性提示病毒復(fù)制活躍。核苷（酸）類似物主要是抗病毒，提高免疫及恢復(fù)肝功，具有不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)，在臨床上被廣泛用來(lái)抗病毒治療[1]。由于核苷類似物可以抑制乙肝病毒復(fù)制的轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)，并無(wú)直接清除作用，就需要長(zhǎng)期的用藥[2]。實(shí)驗(yàn)對(duì)慢性乙型肝炎e抗原陰性的患者做A1896位點(diǎn)變異檢測(cè)與臨床用藥進(jìn)行觀察研究。

1 材料與方法

1.1 病理資料及標(biāo)準(zhǔn) 所有標(biāo)本均來(lái)自長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院住院患者。選取慢性乙型肝炎患者230例且乙肝病毒e抗原陰性，排除藥物性、酒精性、自身免疫性和代謝性肝病。

1.2 儀器與實(shí)驗(yàn)方法 熒光定量PCR測(cè)定儀；貝克曼DXI800； 電化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)乙型肝炎；熒光定量PCR檢測(cè)HBV-DNA；熒光定量PCR檢測(cè)HBV1896位點(diǎn)變異。

1.3 PCR擴(kuò)增 實(shí)時(shí)熒光技術(shù)對(duì)核酸進(jìn)行定量檢測(cè)，核酸提取開始加入內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)經(jīng)過(guò)核酸提取后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 結(jié)果判定 待測(cè)樣品在混合液A檢測(cè)Ct值≤38，混合液B為陰性，判斷待檢樣品為HBV1896變異型，如果Ct值在38～40之間，重復(fù)檢測(cè)一次，如果Ct值仍在38～40之間，則判斷為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P值取雙側(cè)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乙肝病毒e抗原陰性的患者體內(nèi)病毒復(fù)制情況 在230例患者中HBV-DNA陽(yáng)性的有168例，占總?cè)藬?shù)的44.2%，陽(yáng)性以HBV-DNA＞102copies/mL為標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

2.2 HBV-DNA的滴度與A1896位點(diǎn)變異情況分析 依據(jù)病毒含量進(jìn)行分組，研究顯示病毒載量與A1896位點(diǎn)的變異存在一定的關(guān)系，病毒載量在5×106及以上時(shí)，變異率越高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 乙肝病毒e抗原陰性病毒載量分析

表2 病毒載量與變異情況分析

2.3 核苷類抗病毒藥物治療A1896位點(diǎn)變異療效的分析 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用3種核苷類抗病毒藥物對(duì)1896位點(diǎn)變異和未變異的患者進(jìn)行療效判斷，觀察其單藥用藥時(shí)間為3～6個(gè)月的療效。研究發(fā)現(xiàn)，恩替卡韋變異組治療效果顯著（P＜0.05），見表3。

表3 單藥治療變異組與未變異組的比較

3 討論

乙型肝炎病毒侵入機(jī)體后，在肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制繁殖。乙型肝炎病毒基因組DNA在肝細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，在合成核心顆粒后，被轉(zhuǎn)運(yùn)到肝細(xì)胞漿內(nèi)，在通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜時(shí)合成其外殼部分，并以發(fā)芽的形式釋放出肝細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙肝病毒e抗原陰性不代表患者病毒停止復(fù)制，需要做病毒載量的檢測(cè)。Pollicino等對(duì)40例乙型肝炎患者的檢測(cè)研究中發(fā)現(xiàn)基因突變對(duì)乙肝的復(fù)制能力無(wú)影響[3]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。慢性乙肝病毒感染的過(guò)程比較復(fù)查，需要經(jīng)歷四個(gè)時(shí)期[4]，乙型肝炎感染的各期是否與病毒載量存在相關(guān)性影響，將進(jìn)行下一步研究。人體感染乙型肝炎病毒后，可引起細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答，并激發(fā)自身免疫反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，致使病變的肝細(xì)胞產(chǎn)生或釋放大量正?；虍惓５牡鞍踪|(zhì)，進(jìn)一步促使免疫損害加重，使病情不斷發(fā)展。核苷類似物治療A1896位點(diǎn)變異的慢性乙型肝炎患者時(shí)，恩替卡韋的療效顯著。對(duì)慢性乙型肝炎期患者，A1896位點(diǎn)突變應(yīng)盡快接受治療，包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、改善肝功能和抗肝纖維化治療等，但關(guān)鍵是抗病毒治療。其目標(biāo)是最大限度地長(zhǎng)期抵制或消除HBV，減輕肝細(xì)胞炎癥及其所致的肝纖維化，延緩疾病進(jìn)展，減少肝硬化，原發(fā)性肝癌及其并發(fā)癥的發(fā)生，從而延長(zhǎng)病人的生存時(shí)間和生活質(zhì)量。目前，乙肝的抗病毒治療已經(jīng)有了大幅的進(jìn)展，但受病毒的變異、人體免疫耐受等因素的影響，容易產(chǎn)生耐藥性，故研制高效低毒的抗病毒藥勢(shì)在必行。