結(jié)直腸癌及其動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

李 萍，李超英，張大方

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率占全球惡性腫瘤排名第3名和第4名[1]。在中國，2014年CRC的發(fā)病率和病死率分別為37.1/100萬和17.9/100萬，位居所有腫瘤的第3位和第5位。根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)[2]，認(rèn)為結(jié)直腸癌的發(fā)病與遺傳、環(huán)境因素和飲食等有關(guān)。結(jié)直腸癌病死率升高的原因除了有原發(fā)癌癥的影響外，還有癌癥轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，例如肝轉(zhuǎn)移[3]。結(jié)直腸癌的病理機(jī)制復(fù)雜多樣，為了與臨床研究結(jié)合，模擬臨床結(jié)直腸癌的發(fā)病進(jìn)程，選擇合適的動(dòng)物模型有著至關(guān)重要的作用。目前，結(jié)直腸癌動(dòng)物模型可分為3種：一種是化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)成瘤，另一種是接種結(jié)直腸癌細(xì)胞或組織致使動(dòng)物產(chǎn)生腫瘤，最后一種是當(dāng)前流行的基因工程方法使動(dòng)物成瘤，其中基因工程模型研究發(fā)展迅速。本文就現(xiàn)有的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型進(jìn)行綜述。

1 動(dòng)物造模方法

1.1 化學(xué)誘發(fā)性模型 目前最常用的誘導(dǎo)劑是二甲肼（DMH）和氧化偶氮甲烷（AOM），其致癌效果佳，器官選擇性好。劉艷翠等[4]在Wistar大鼠皮下注射二甲肼以致誘發(fā)結(jié)直腸癌，在給藥后12、18、24周處死動(dòng)物，比較3個(gè)時(shí)間點(diǎn)腫瘤的發(fā)生率、結(jié)直腸癌的發(fā)生率，結(jié)果24周最高。Marion等[5]用二甲肼誘發(fā)BALB/c小鼠結(jié)直腸癌，連續(xù)給藥10周，發(fā)現(xiàn)60%的動(dòng)物在20～24周左右出現(xiàn)腫瘤。

隨著研究深入，后期實(shí)驗(yàn)研究多用AOM聯(lián)合葡聚糖硫酸鈉（DSS）方法，此方法是目前常用的化學(xué)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌模型。LaurenC等[6]通過聯(lián)合應(yīng)用AOM和DSS，誘導(dǎo)C57BL/6小鼠發(fā)生結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌；另有報(bào)道[7]也證實(shí)，一次性腹腔注射AOM（10 mg/kg）聯(lián)合DSS三循環(huán)喂養(yǎng)，可建立小鼠從潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)展到腫瘤的動(dòng)態(tài)全過程。侯冰宗等[8]采用二甲肼頸部皮下注射建立模型，觀察結(jié)果為二甲肼可以誘導(dǎo)結(jié)直腸癌并發(fā)生轉(zhuǎn)移，但腫瘤轉(zhuǎn)移率過低，不能應(yīng)用研究結(jié)直腸癌并發(fā)轉(zhuǎn)移的試驗(yàn)。

1.2 移植瘤模型 移植瘤模型根據(jù)種植部位的不同可分為異位移植瘤模型和原位移植瘤模型。目前，常用的結(jié)直腸癌細(xì)胞株主要分為人源性細(xì)胞株和鼠源性細(xì)胞株，其中，人源性細(xì)胞株應(yīng)用廣泛的是HCT116和HT29細(xì)胞株；鼠源性細(xì)胞株研究應(yīng)用較多的是CT26細(xì)胞株。

1.2.1 異位移植瘤模型 異位移植瘤是移植腫瘤最簡便的方法，其中，將結(jié)直腸癌細(xì)胞或組織懸液接種于小鼠皮下所建立的皮下移植瘤模型是應(yīng)用最為廣泛的模型之一。JIANG等[9]成功建立腫瘤細(xì)胞系傳代移植瘤模型,此方法是通過在小鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞混懸液，成功建立原代CT26的小鼠皮下模型，并進(jìn)行傳代腫瘤移植的模型。皮下移植瘤模型操作簡單，便于觀察和測量，可重復(fù)性好，所建模型在監(jiān)測腫瘤進(jìn)展、檢測相關(guān)腫瘤因子、篩選藥物和評估治療性干預(yù)效果等方面具有優(yōu)勢。然而，由于皮下微環(huán)境與結(jié)直腸完全不同，該模型大多不能發(fā)生轉(zhuǎn)移。

除皮下移植模型外，結(jié)腸癌細(xì)胞直接注入脾臟[10-11]、門靜脈[12]和尾靜脈[13]均可成功建立結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移模型。這種實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型的優(yōu)勢是造模時(shí)間短，模型具有高度的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

1.2.2 原位移植瘤模型 原位移植的接種部位常選盲腸與直腸，有較高的移植成功率。腫瘤細(xì)胞株移植后的腫瘤形成只需數(shù)周，Liao等[14]將HCT116和HT29細(xì)胞接種到裸鼠盲腸漿膜下，成功構(gòu)建了結(jié)直腸癌原位移植模型。譚小寧等[15]應(yīng)用該法建立結(jié)直腸癌模型，用于研究健脾消癌方對結(jié)腸癌的治療效果及其機(jī)制。

研究人員為了克服原位模型不能反映人類CRC的病理組織學(xué)特征的局限性，研究出目前應(yīng)用較廣泛的患者腫瘤組織移植法（Patient-Derived Xenograft，PDX模型）。PDX模型是通過將患者腫瘤部分（如組織碎片或直接通過手術(shù)獲得的分離細(xì)胞）植入免疫缺陷小鼠而產(chǎn)生的模型。與傳統(tǒng)的細(xì)胞移植模型（Cellline-Derived Xenograft，CDX）相比，PDX模型被認(rèn)為是先進(jìn)的臨床前模型[16]。不同于來自體外環(huán)境培養(yǎng)的克隆性腫瘤或來源基于細(xì)胞系的異種移植物，PDX模型是直接從新鮮患者組織中獲得并通過體內(nèi)傳代培養(yǎng)的腫瘤樣本。因此，PDX模型具有臨床結(jié)直腸癌的病理組織學(xué)、細(xì)胞和分子準(zhǔn)確度的特點(diǎn)[17-18]。

以上建立的模型，都可以模擬人結(jié)直腸癌生物學(xué)特性，是腫瘤防治及轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的理想模型。例如，李凌云等[19]采用CT26細(xì)胞株或組織種于BALB/c小鼠盲腸漿膜下層，成瘤及肝轉(zhuǎn)移率發(fā)生分別為100%、60%。Fumagalli A等[20]成功建立原位類器官移植瘤模型，并發(fā)現(xiàn)在腸微環(huán)境生長的腫瘤，具有向肝、肺轉(zhuǎn)移的能力。與自發(fā)轉(zhuǎn)移模型相比，這些模型的轉(zhuǎn)移形成更為明顯。使用這些模型能夠控制引入到循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量和類型，這對于確定實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)是很重要的。此外，器官轉(zhuǎn)移的部位具有靶向特異性位點(diǎn)作用。但是，這些模型不能代表整個(gè)轉(zhuǎn)移過程。它們僅代表結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移晚期，因?yàn)樗鼈兝@過了早期階段，包括原發(fā)腫瘤生長和腫瘤細(xì)胞的血管內(nèi)浸潤。移植瘤模型遵循的是人工路線，而不是自然路線。

1.3 轉(zhuǎn)基因模型 根據(jù)CRC的分子學(xué)病因機(jī)制與特點(diǎn)建立此類模型。目前承認(rèn)CRC的有序遺傳模型中，APC失活（＞80% CRC）是起始事件，其次是發(fā)生突變：激活KRAS或BRAF（＞40% CRC），通過SMAD基因家族成員或TGF-β受體的失活，導(dǎo)致TGF-β通路失活（＞20%CRC），TP53失活突變（＞60% CRC）。針對這些關(guān)鍵的CRC基因，建立相應(yīng)途徑的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。Takeda H等[21]利用SB轉(zhuǎn)座子誘變篩選法進(jìn)行研究，采用包括K-ras、Smad4和Tp53突變的小鼠品系，用于篩選CRC驅(qū)動(dòng)基因。通過使用這些小鼠模型，作者發(fā)現(xiàn)與這三個(gè)基因協(xié)同的突變，不僅產(chǎn)生在腫瘤早期，而且在腫瘤發(fā)展中仍有變化。

2 結(jié)論與展望

綜上所述，結(jié)直腸癌常選用小鼠或大鼠作為動(dòng)物模型，因?yàn)樗鼈兪巧镝t(yī)學(xué)研究中使用歷史最長的動(dòng)物品系，對各種營養(yǎng)物質(zhì)比較敏感，廣泛用于藥物、腫瘤、關(guān)節(jié)炎等醫(yī)學(xué)研究。結(jié)直腸癌動(dòng)物模型在CRC病因及其治療發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，但是，尚缺少理想的CRC動(dòng)物模型。四種不同的CRC模型只能分別模擬人類CRC的特點(diǎn)，因此要根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇其相對較優(yōu)的模型。目前在抗腫瘤藥研究中，常將移植法和化學(xué)誘導(dǎo)法兩種不同造模方法相結(jié)合。采取移植法能更準(zhǔn)確闡明抗腫瘤藥對移植瘤的研究，而在整體研究中選用化學(xué)誘導(dǎo)法，為了觀察癌癥從發(fā)生到發(fā)展各階段的變化。在腫瘤研究中，既要考慮抑制腫瘤的發(fā)展，還要考慮到免疫與腫瘤的關(guān)系。

最近，癌癥免疫法已經(jīng)成功地應(yīng)用于治療多種類型的癌癥?，F(xiàn)在應(yīng)該通過開展抗腫瘤中藥復(fù)方CRC動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)、抑制腫瘤生長及生存期和腫瘤遷移實(shí)驗(yàn)研究等，揭示其抗腫瘤與機(jī)體免疫的作用，從而對抗腫瘤中藥進(jìn)行全面作用機(jī)理研究。總之，CRC動(dòng)物模型仍需要進(jìn)一步完善，以便應(yīng)對各種癌癥藥物藥效和機(jī)理發(fā)展研究的需要。