Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化板藍(lán)根總黃酮的超聲提取工藝及其抗氧化活性研究

梁艷妮，朱 佳，唐志書，孫曉春，劉世軍，宋忠興，王 征

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712083）

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根，主產(chǎn)于江蘇、河北，具有清熱解毒、涼血利咽作用[1]。臨床常用于溫疫時(shí)毒，發(fā)熱咽痛、流行性感冒、腮腺炎、急性扁桃體炎等病癥，具有抗病毒、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用[2]。板藍(lán)根證實(shí)含有生物堿、木質(zhì)素、神經(jīng)酰胺、黃酮、有機(jī)酸類、蒽醌類、芥子苷類等近百個(gè)化合物[3-6]。有關(guān)板藍(lán)根總生物堿及多糖的提取工藝研究較多[7-8]，但對(duì)于板藍(lán)根黃酮的提取工藝研究僅有一篇[9]。黃酮類化合物因具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性受到廣泛關(guān)注[10]。超聲波提取法具有能耗低、效率高和不破壞黃酮分子結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)[10-11]。Box-Behnken效應(yīng)面法采用多項(xiàng)式擬合各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，比正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果更優(yōu)良[12-13]。本實(shí)驗(yàn)擬通過單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面分析法優(yōu)化板藍(lán)根總黃酮的超聲乙醇提取工藝，為板藍(lán)根總黃酮的藥理活性研究與開發(fā)提供參考。

1 材料

板藍(lán)根（批號(hào)：20171101，產(chǎn)地河北）為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根，購于陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定。蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：wkq16031602，純度：HPLC≥98%），購自四川省維克奇生物科技有限公司；所用試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

UV-2600型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；GB204 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；FA2004B型萬分之一電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；VaCo5低溫冷凍干燥儀（Zibrus Technology）；HH-2型恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；FE-1000AD固體粉碎機(jī)（天津鑫博得儀器有限公司）。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以蘆丁為對(duì)照品采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。即精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，60%乙醇溶解配制200 μg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。精密量取1 mL，2 mL，4 mL，6 mL，8 mL的對(duì)照品溶液分別置于25 mL容量瓶中，以空白為對(duì)照，加60%乙醇至8 mL振搖，各加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，振搖，靜置6 min；各加10%硝酸鋁溶液1 mL，振搖，靜置6 min；各加4%氫氧化鈉溶液4 mL，60%乙醇定容，搖勻，靜置15 min，在波長510 nm測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得線性回歸方程 ：Y = 12.434 X- 0.003 5（r = 0.999 8），線性范圍：8 ～ 64 μg/mL。

2.2 板藍(lán)根總黃酮提取單因素試驗(yàn) 將干燥板藍(lán)根藥材粉碎，精確稱取干燥的板藍(lán)根粉末5 g于250 mL三角瓶中，在考察提取因素條件下（料液比、提取時(shí)間和乙醇濃度）加入乙醇水溶液，超聲提取[11]（固定功率為300 W，提取溫度為室溫）一定時(shí)間，過濾，石油醚萃取后將下層溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無水狀，60%乙醇定容，搖勻?yàn)榇郎y液，按照“2.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮提取率，確定各因素適宜提取條件。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選的料液比、乙醇濃度和提取時(shí)間，采用Design-Expert. V8.0.6軟件中Box-Behnken模型設(shè)計(jì)試驗(yàn)組，以料液比（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇濃度（C）三個(gè)因素為自變量，將板藍(lán)根總黃酮提取率作為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

2.4 抗氧化活性測定 將采用最佳工藝提取的板藍(lán)根粗黃酮配成質(zhì)量濃度為12 mg/mL的水溶液，膜壓差為80 kPa過0.2 μ陶瓷膜純化除雜后作抗氧化活性測定。

2.4.1 DPPH·清除活性 按照陳智坤等[15]清除DPPH·的方法，向6支試管中分別加入 2 mL 6 mmol/L的DPPH· 乙醇溶液和2 mL 系列濃度的板藍(lán)根黃酮乙醇溶液，充分混合，室溫避光反應(yīng) 30 min后測定在 517 nm處的吸光度 A實(shí)驗(yàn)；以等體積的無水乙醇代替板藍(lán)根黃酮溶液測得吸光度為 A空白；以等體積的無水乙醇代替 DPPH·乙醇溶液測得吸光度為 A對(duì)照。DPPH·清除能力計(jì)算公式為：清除率（%）= [1 -（A實(shí)驗(yàn)- A對(duì)照）/A空白]×100%。

2.4.2 ·OH清除活性 參考汪荔等[16]清除·OH的方法，在6支試管中分別依次加入 6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，不同質(zhì)量濃度板藍(lán)根黃酮溶液 2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置 10 min后再加 6 mmol/L水楊酸溶液 2 mL，搖勻，水浴 37 ℃保溫 30 min 后于510 nm 處測得不同黃酮濃度下的吸光度 Ai；用水代替水楊酸乙醇溶液時(shí)測得本底吸光度 Aj，用水代替黃酮溶液是測得空白對(duì)照吸光度 A0?！H清除率（%）= [1-（Ai-Aj）/A0] ×100%。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 料液比對(duì)板藍(lán)根總黃酮提取率的影響 在超聲功率300 W，乙醇濃度60%，提取20 min條件下考察料液比 1：10，1：15，1：20，1：25，1：30，1：35 對(duì)黃酮提取率的影響。從圖1可以看出，板藍(lán)根黃酮提取率隨提取溶劑用量增大先增大后減小，在料液比為1：25時(shí)，總黃酮提取率最大。

圖1 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

3.1.2 乙醇濃度對(duì)板藍(lán)根總黃酮提取率的影響 在超聲功率300 W，料液比1：25，提取20 min條件下考察30%，40%，50%，60%，70%，80%乙醇對(duì)總黃酮提取率的影響。從圖2可以看出，板藍(lán)根黃酮提取率隨乙醇濃度增大先增大后減小，提取溶劑濃度與總黃酮極性相關(guān)，乙醇濃度為60%時(shí)總黃酮提取率最大。

圖2 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

3.1.3 提取時(shí)間對(duì)板藍(lán)根總黃酮提取率的影響 在超聲功率300 W，料液比1：25，乙醇濃度60%條件下考察超聲10，15，20，25，30，35 min對(duì)總黃酮提取率的影響。從圖3可以看出，超聲時(shí)間對(duì)總黃酮的提取率影響也存在極值范圍，隨著超聲時(shí)間延長雜質(zhì)溶出量增大，超聲時(shí)間20 min時(shí)總黃酮提取率最大。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)表1中3因素3水平編碼設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果，見表3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行回歸分析，得到料液比、乙醇濃度和超聲時(shí)間對(duì)板藍(lán)根總黃酮提取率影響的二次多項(xiàng)回歸方程：Y = 2.71-0.074A-0.047B-0.027C-0.018AB-0.16AC+0.029BC-0.20A2-0.099B2-0.15C2。從表3可知該模型極顯著（P＜0.0001），失擬項(xiàng)檢驗(yàn)P = 0.0513＞0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著。以上表明該二次方程模型擬合度好，實(shí)驗(yàn)誤差小，能夠準(zhǔn)確反映3因素對(duì)板藍(lán)根總黃酮提取率的影響，可以利用此模型對(duì)板藍(lán)根總黃酮的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化分析。從表3可看出，一次項(xiàng)A，B，C，交互項(xiàng)AC，BC，二次項(xiàng)A2，B2，C2對(duì)響應(yīng)值影響極顯著，僅交互項(xiàng)AB影響顯著。比較各項(xiàng)F值可知各因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小為A＞B＞C，即料液比＞提取時(shí)間＞乙醇濃度。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析

3.2.2 響應(yīng)面圖分析 通過多元回歸方程作三維效應(yīng)曲面圖和二維平面等高線圖，從圖4-6可以直觀分析三個(gè)因素之間的交互作用以及對(duì)總黃酮提取率的影響。

圖4 料液比與提取時(shí)間對(duì)板藍(lán)根黃酮提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖5 料液比與乙醇濃度對(duì)對(duì)板藍(lán)根黃酮提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖6 提取時(shí)間與乙醇濃度對(duì)板藍(lán)根黃酮提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖

由圖4料液比與提取時(shí)間交互作用顯示，料液比變化曲面比提取時(shí)間變化曲面陡峭；等高線沿料液比方向變化稍高于提取時(shí)間方向且呈橢圓形，表明料液比對(duì)響應(yīng)值的影響比提取時(shí)間稍大，二者之間交互作用顯著。由圖5料液比與乙醇濃度交互作用顯示，料液比變化曲面比乙醇濃度變化曲面稍陡峭；等高線沿料液比方向變化稍高于乙醇濃度方向且呈橢圓形，表明料液比對(duì)響應(yīng)值的影響比乙醇濃度大，二者交互作用極顯著。由圖6提取時(shí)間與乙醇濃度交互作用顯示，提取時(shí)間與乙醇濃度對(duì)響應(yīng)值的影響相當(dāng)，二者交互作用極顯著。

3.2.3 試驗(yàn)驗(yàn)證 根據(jù)響應(yīng)面分析確定超聲提取板藍(lán)根總黃酮的最佳工藝參數(shù)為：料液比為1：29，提取時(shí)間為18 min，乙醇濃度為55%，對(duì)應(yīng)總黃酮提取率為2.60%。用上述最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，總黃酮三次平均提取率為2.56%，與預(yù)測值的相對(duì)誤差為1.5%，說明所得最佳工藝條件穩(wěn)定，具有實(shí)用價(jià)值。

3.3 抗氧化活性

3.3.1 板藍(lán)根黃酮對(duì)DPPH·清除作用 從圖7可看出板藍(lán)根黃酮對(duì)DPPH·的清除率隨著濃度增大而增強(qiáng)，在2～20 mg/mL范圍內(nèi)呈一定量效關(guān)系。當(dāng)板藍(lán)根總黃酮質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)清除率達(dá)80.30%。

圖7 不同濃度板藍(lán)根總黃酮對(duì)DPPH·的清除作用

3.3.2 板藍(lán)根黃酮對(duì)·OH清除作用 從圖8可看出板藍(lán)根黃酮對(duì)·OH的清除率隨著濃度增大而增強(qiáng)，在2～20 mg/mL范圍內(nèi)呈一定量效關(guān)系。當(dāng)板藍(lán)根總黃酮質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1時(shí)清除率達(dá)82.40%。

圖8 不同濃度板藍(lán)根總黃酮對(duì)·OH的清除作用

4 討論

在提取工藝參數(shù)的優(yōu)化中，影響因素和響應(yīng)值之間往往具有高度非線性關(guān)系，響應(yīng)面法通過設(shè)計(jì)有限次數(shù)試驗(yàn)，建立包括各因素一次項(xiàng)、平方項(xiàng)和交互項(xiàng)的多元二次模型，擬合因素與響應(yīng)值間的全局函數(shù)關(guān)系。對(duì)影響響應(yīng)值的各因素水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)，可快速有效地確定多因素影響的最佳條件，精度高，預(yù)測性好。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken效應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)以優(yōu)化板藍(lán)根總黃酮的超聲提取工藝，建立的二次多項(xiàng)回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，擬合度好，能夠準(zhǔn)確地反映料液比、乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)板藍(lán)根總黃酮提取率的影響。利用此模型得到的板藍(lán)根總黃酮超聲提取最佳條件為料液比1：29，提取時(shí)間18 min和乙醇濃度55%，提取時(shí)間短，方法簡便，黃酮提取率可達(dá)2.60%。由驗(yàn)證試驗(yàn)可知Box-Behnken效應(yīng)面法得到的理論優(yōu)化結(jié)果可靠。采用非線性擬合模型接近客觀事實(shí)，效應(yīng)面三維圖使因素對(duì)指標(biāo)的影響更為直觀、方便。

0.2 μm陶瓷膜分離純化后的板藍(lán)根總黃酮對(duì)DPPH·和·OH的清除能力具有濃度依賴性，總黃酮濃度在20 mg/mL時(shí)對(duì)此2種自由基的清除率可達(dá)80%以上。板藍(lán)根黃酮的強(qiáng)抗氧化性為其進(jìn)一步的開發(fā)提供了理論依據(jù)。