雙特異性溶瘤腺病毒通過調(diào)節(jié)活性氧引起人肺癌細(xì)胞凋亡

白 冰，張冬娜，蔣本春，房金波，馬藝珍，朱羿龍，朱光澤，李 霄，金寧一

（長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省院士工作站，長春 130117）

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率在過去幾十年間迅速增長，已成為我國城市人口惡性腫瘤死亡原因的第一位。非小細(xì)胞肺癌包括腺癌、大細(xì)胞癌，鱗狀細(xì)胞癌，與小細(xì)胞肺癌相比具有癌細(xì)胞生長分裂速度慢，擴散轉(zhuǎn)移晚等特點。非小細(xì)胞肺癌發(fā)生率約占所有類型肺癌的80～85%，約75%的患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，五年生存率極低[1]。肺癌占所有男性癌癥的18%，占全部女性癌癥的7%。

近十年來，世界各國已經(jīng)應(yīng)用多種溶瘤腺病毒在Ⅰ期和Ⅱ期臨床實驗中對數(shù)百位患者進行治療，而且中國已經(jīng)率先批準(zhǔn)了溶瘤腺病毒用于腫瘤治療，美國和歐洲目前也在進行有關(guān)溶瘤腺病毒的Ⅲ期臨床試驗[2]。Onyx-015是由美國Onyx公司開發(fā)的一種能夠在腫瘤細(xì)胞中特異性復(fù)制并裂解腫瘤細(xì)胞的腺病毒藥物。Onyx-015可與化療聯(lián)合運用于腫瘤治療，具有良好的療效。研究表明，溶瘤腺病毒對對肺癌[3]、膀胱癌[4]、前列腺癌[5]、乳腺癌[6]、胃癌[7]等多種腫瘤細(xì)胞均有顯著性抑制作用。本研究所采用的基于腫瘤特異性啟動子hTERTp、病毒復(fù)制必須基因E1A和凋亡素基因Apoptin通過RAPAd.I腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建而成的溶瘤腺病毒ATV是由李霄[8]等構(gòu)建，具有腫瘤特異性殺傷和腫瘤特異性復(fù)制能力的雙特異性溶瘤腺病毒。ATV通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡抑制腫瘤細(xì)胞增殖，ATV誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞及人肺癌細(xì)胞凋亡的凋亡率分別可達(dá)到（45.315±5.013）%[9]和（73.96±2.31）%[10]。本研究通過CCK-8檢測、Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)、胞漿活性氧檢測一系列體外實驗驗證雙特異性溶瘤腺病毒可通過調(diào)節(jié)活性氧水平引起人肺癌細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒與主要試劑 雙特異性溶瘤腺病毒（ATV）由本實驗室構(gòu)建并保存，人肺癌細(xì)胞A549由本實驗室凍存。0.25%胰酶，胎牛血清購自BI公司；F12培養(yǎng)液購自Hyclone公司；CCK-8檢測試劑盒購自東仁化學(xué)科技有限公司；Hoechst染料購自美國Lf i e公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BD公司；人活性氧（ROS）ELISA試劑盒購自默沙克生物科技公司。

1.2 CCK-8檢測法檢測A549細(xì)胞增殖 將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以5×103個/孔密度培養(yǎng)于96孔板中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用1、10、50 moi兩種重組腺病毒ATV和Ad-Mock感染A549細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm測定各孔OD值，通過公式計算ATV對兩種細(xì)胞抑制率，確定最佳感染劑量。

1.3 Hoechst染色法檢測A549細(xì)胞的凋亡情況 將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以4×105個/孔密度培養(yǎng)于6孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用50 moi的兩種重組腺病毒ATV和Ad-Mock分別感染兩種細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h，每孔加入稀釋后的Hoechst 100 μL，避光孵育15 min，倒置在熒光顯微鏡下拍照并分析結(jié)果。

1.4 Annexin V-FITC/PI流式法檢測ATV誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡率 將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以2.5×105個/孔密度培養(yǎng)于6孔板中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用50 moi兩種重組腺病毒ATV和Ad-Mock感染A549細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h，向細(xì)胞中加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育20 min，利用FACS流式細(xì)胞儀進行檢測并分析結(jié)果。

1.5 胞漿活性氧檢測 將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以5×103個/孔密度培養(yǎng)于96孔板中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用50 moi兩種重組腺病毒ATV和Ad-Mock感染A549細(xì)胞，于12、24、48、72 h用活性氧檢測試劑盒中的樣品稀釋液將細(xì)胞吹下，超聲破碎3 000 r/min離心10 min，取上清為待檢樣品。參照說明書將樣品稀釋液 48 μL，及上述各待測樣品 2 μL加于酶標(biāo)板孔底部，晃動混勻。置 37 ℃溫箱中溫育 30 min，加入洗滌液洗滌五次，拍干。除空白孔外每孔加入酶標(biāo)試劑 50 μL，依照以上步驟再溫育和洗滌一次。每孔先加入顯色劑 A 50 μL，再加入顯色劑 B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，用酶標(biāo)儀在450 nm測定各孔OD值。

1.6 統(tǒng)計方式 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并且以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s ）表示，組間比較均采用t檢驗，規(guī)定P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測ATV對A549細(xì)胞增殖的抑制作用 CCK-8檢測結(jié)果表明，ATV對A549細(xì)胞具有明顯抑制作用，且該作用具有時效與劑效關(guān)系，而Ad-Mock對A549細(xì)胞無明顯抑制作用。如圖1所示，ATV在12、24、48、72 h對A549細(xì)胞均具有不同程度的抑制作用，且抑制率隨時間的增長而增強；劑量分別為1 moi、10 moi、50 moi的ATV對A549細(xì)胞均具有不同程度的抑制作用，且抑制率隨劑量的增加而增強，感染劑量為1 moi時，ATV對A549細(xì)胞的抑制作用隨時間的增長無明顯變化（P＞0.05）且在各個時間點，ATV與Ad-Mock對A549細(xì)胞的抑制作用均無明顯差異（P＞0.05），感染劑量為10 moi和50 moi時，ATV對A549細(xì)胞抑制作用隨時間的增長顯著增強（P＜0.05）且ATV與Ad-Mock對A549細(xì)胞的抑制作用在48與72 h存在顯著性差異（P＜0.05），由該結(jié)果可得出結(jié)論：50 moi為ATV的最佳感染劑量。

圖1 CCK-8法檢測ATV對A549細(xì)胞的抑制率

2.2 Hoechst法檢測ATV對A549細(xì)胞的抑制方式 Hoechst能夠與細(xì)胞DNA結(jié)合，經(jīng)紫外光激發(fā)后發(fā)出藍(lán)色熒光。在熒光顯微鏡下觀察到感染50moi ATV與Ad-Mock后的A549細(xì)胞如圖2所示，ATV感染后的A549細(xì)胞，48、72 h均有部分細(xì)胞呈核碎裂典型的濃染和邊集現(xiàn)象，隨著時間的增長，該現(xiàn)象更加明顯；而Ad-Mock感染后的A549細(xì)胞呈現(xiàn)均一的藍(lán)色熒光。由該結(jié)果可知，ATV能夠引起A549細(xì)胞凋亡。

2.3 Annexin V-FITC/PI流式法檢測ATV對A549細(xì)胞抑制途徑 通過Annexin V-FITC/PI流式檢測，如圖3所示，表明ATV可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨時間的增長而增大，具有時間效應(yīng)，而Ad-Mock對A549細(xì)胞凋亡無明顯影響。在48與72 h，A549細(xì)胞的凋亡率分別為50.54%和75.30%，ATV與Ad-Mock對A549細(xì)胞的凋亡率存在顯著性差異（P＜0.05），該結(jié)果表明ATV可引起A549細(xì)胞凋亡。

2.4 胞漿活性氧水平檢測結(jié)果 胞漿活性氧檢測結(jié)果如圖4所示，ATV感染A549細(xì)胞12、24、48、72 h，細(xì)胞活性氧水平隨時間的增長而提高，具有時間效應(yīng)，而Ad-Mock組和A549細(xì)胞對照組細(xì)胞活性氧水平隨時間的增長無明顯變化（P＞0.05），在48 h與72 h，ATV感染的A549細(xì)胞中活性氧水平顯著高于Ad-Mock組和A549細(xì)胞對照組（P＜0.05），A549細(xì)胞凋亡率隨A549細(xì)胞中活性氧含量的增加而提高，該結(jié)果表明ATV可通過調(diào)節(jié)A549細(xì)胞中活性氧水平引起A549細(xì)胞凋亡。

3 討論

圖2 Hoechst 染色檢測ATV對A549細(xì)胞抑制方式（400×）

圖3 Annexin V-FITC/PI流式檢測ATV對A549細(xì)胞抑制途徑

圖4 A549細(xì)胞胞漿活性氧水平

活性氧（ROS）是細(xì)胞新陳代謝過程中產(chǎn)生的帶有未成對電子的原子、原子團或分子，具有穩(wěn)定性極低、易分解等特點。包括過氧化氫、超氧陰離子、一氧化氮自由基及羥基自由基等[11]。ROS主要儲存在線粒體和還原性輔酶Ⅱ等氧化酶類中，其中線粒體是ROS產(chǎn)生最重要的場所。約有90%的ROS在線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的過程，由分子氧經(jīng)線粒體內(nèi)膜呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ及復(fù)合體Ⅲ傳遞產(chǎn)生。ROS作為信號分子能引起腫瘤細(xì)胞自噬、凋亡、耐藥及增殖抑制。ROS介導(dǎo)的凋亡途徑包括：通過增加線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，使細(xì)胞色素C釋放，激活半脫氨酸蛋白酶，活化caspases-9，并形成凋亡小體及多種蛋白復(fù)合物，進而活化下游 caspase-3，放大死亡信號，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-14]。也可以通過泛素化使 caspase-8 蛋白的表達(dá)減少從而誘導(dǎo)凋亡。ROS也可以通過激活p53從而調(diào)節(jié)Wnt/β -catenin途徑及介導(dǎo) NF-κB從而引起凋亡。

在雷公藤紅素作用腫瘤細(xì)胞的過程中，陳國柱等[15]、張志強等[16]研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 H1299 的殺傷作用與細(xì)胞內(nèi) ROS 的蓄積和 NF-κB通路的活性抑制有關(guān)。另外一些研究表明雷公藤紅素還可以通過 ROS/JNK 通路誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞[17]、骨肉瘤細(xì)胞[18]等的凋亡。此外，ROS 也與腫瘤耐藥性有關(guān)，誘導(dǎo) ROS 產(chǎn)生可以增加腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[19]。β-胡蘿卜素作用于食管鱗癌細(xì)胞后，能夠引起細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，降低線粒體膜電位，觸發(fā)細(xì)胞色素C 的釋放，從而誘導(dǎo)凋亡蛋白 Bax 表達(dá)降低，蛋白Bcl-2、Casepase-3 表達(dá)增加，促使食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，證明β-胡蘿卜素能夠通過調(diào)節(jié)ROS水平促進食管鱗癌細(xì)胞凋亡從而對其起到抑制作用[19]。青蒿琥酯可以誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，活性氧引起 Bcl-2 水平下調(diào)以及 Bax 水平上調(diào)，使線粒體通透性增加、膜電位喪失，釋放細(xì)胞色素C，激發(fā)典型的線粒體凋亡通路，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡從而對其起到了抑制作用[20]。

本研究通過CCK-8明確了ATV能夠顯著性抑制A549細(xì)胞的增殖，通過Hoechst和Annexin V-FITC/PI流式確定了ATV能夠?qū)е翧549細(xì)胞凋亡，表明了ATV主要通過誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的方式來抑制A549細(xì)胞的增殖。通過檢測A549細(xì)胞內(nèi)胞漿活性氧水平，明確了ATV誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡與胞內(nèi)活性氧含量的關(guān)系，即A549細(xì)胞的凋亡率隨細(xì)胞中活性氧含量增加而升高，驗證了雙特異性溶瘤腺病毒ATV可通過調(diào)節(jié)活性氧水平引起人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡。