紫蘇子湯對(duì)哮喘小鼠TNF-α、白細(xì)胞介素-8、白介素-1β表達(dá)的影響*

伍 磊

河南省職工醫(yī)院兒童康復(fù)科(鄭州 450002)

哮喘是兒科最為常見(jiàn)的肺部疾病，是一種對(duì)兒童健康造成嚴(yán)重威脅的一種慢性呼吸道疾病，嚴(yán)重影響了兒童正常的生長(zhǎng)發(fā)育及生活學(xué)習(xí)，如果治療不當(dāng)或治療不及時(shí)可能會(huì)致使患兒?jiǎn)适w力活動(dòng)能力，嚴(yán)重的可能會(huì)危及生命。慢性呼吸道疾病大多與炎癥反應(yīng)有密切關(guān)聯(lián)[1]，TNF-α、IL-8、IL-1β同屬于致炎因子，均參與機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)。紫蘇子湯具有降氣平喘和祛痰止咳的功效，對(duì)哮喘有良好的治療效果。本文通過(guò)給予哮喘小鼠紫蘇子湯進(jìn)行治療，探究紫蘇子湯對(duì)哮喘小鼠TNF-α、IL-8、IL-1β表達(dá)水平的影響。

材料與方法

1 動(dòng)物及分組 研究動(dòng)物：選取60例由佳木斯大學(xué)動(dòng)物研究中心提供的Wistar小鼠，雌雄不限，年齡2～3個(gè)月，平均年齡(2.4±0.2)月，體重18～31 g，平均(23.4±2.2)g。所有小鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，放置在室溫(22.3±1.7)℃，相對(duì)濕度35%～40%的環(huán)境中，每天光照12 h，喂飲小鼠純凈水。飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和空白模型組，其中實(shí)驗(yàn)組40例，空白模型組20例，兩組小鼠在年齡、體重上均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性，所做實(shí)驗(yàn)均獲得我院倫理會(huì)批準(zhǔn)。

2 研究方法

2.1 哮喘小鼠模型建立:造模參照文獻(xiàn)[2]的方法，并加以適當(dāng)修改，給予60例小鼠腹腔注射0.1 ml的0.01%卵清蛋白和氫氧化鋁混合溶液，最后調(diào)配成功的混合溶液中含10 g卵清蛋白及20 mg氫氧化鋁凝膠，在第1天和第7天各注射1次，使小鼠致敏。2周后，將60例小鼠放置在6L的密制容器內(nèi)，用1%的卵清蛋白生理鹽水溶液進(jìn)行吸入霧化激發(fā)，是氣霧彌漫整個(gè)密制容器，持續(xù)30 min，1次/d，持續(xù)進(jìn)行1周。小鼠出現(xiàn)焦躁不安、喘息、氣促、哮鳴以及腹肌痙攣為造模成功。

2.2 給藥方法:實(shí)驗(yàn)組給予紫蘇子湯(科室協(xié)定方)，由紫蘇子、半夏各9 g，前胡、厚樸、甘草、當(dāng)歸、橘皮、大棗、生姜、桂心各6 g組成(均選用廣東一方制藥有限公司中藥配方顆粒)，以上藥物由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥房提供，2劑/d，每次取上藥用溫水溶解至50 ml中藥灌胃給藥， 2次/d， 20 min/次，12 h 1次；治療組取等量生理鹽水中藥灌胃給藥治療，2次/d，早晚各1次；兩組治療均為1療程,7 d為1療程。

2.3 標(biāo)本采集:末次激發(fā)結(jié)束后，抽取小鼠腹部血5 ml，放置在干凈的EP管中，經(jīng)過(guò)冷凝處理后，使用離心機(jī)以2000r/min的轉(zhuǎn)速分離，取上層血漿放置-50℃的冰柜中凍存。

2.4 Western blot檢測(cè)TNF-α蛋白、IL-8蛋白、IL-1β表達(dá):用SDS-PAGE凝膠將待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液，靜置15 min；在100V的環(huán)境中電泳10 min后，將電轉(zhuǎn)膜放置在37 ℃的封閉環(huán)境中的搖床上，然后加入10%的牛奶，靜置1.5 h后加入TBST稀釋，按(1∶1000)稀釋，在5℃的環(huán)境下，經(jīng)過(guò)孵育后過(guò)夜保存；第2天使用TBST緩沖液清洗，在室溫的環(huán)境中與二抗結(jié)合，孵育1 h后再次用TBST緩沖液清洗，最后將其浸泡在底物溶液中進(jìn)行顯色，采用BCA蛋白定量試劑盒，分析其灰度值，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值=目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，達(dá)到檢測(cè)TNF-α蛋白、IL-8蛋白、IL-1β蛋白表達(dá)水平的目的。

2.5 RT-PCR檢測(cè)TNF-α mRNA、IL-8 mRNA、IL-1β mRNA表達(dá):采用熒光定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照定量PCR儀的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。依次加入2.5μl的稀釋10倍的PCR緩沖液，1.5μl MgCl2溶液，0.5μl上游引物和下游引物，最后加水配成總體積為25μl的反應(yīng)體系。在94℃環(huán)境中反應(yīng)1 min；55℃環(huán)境中反應(yīng)1 min；72℃環(huán)境中反應(yīng)1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃環(huán)境中反應(yīng)延長(zhǎng)5 min，重復(fù)最少三次。計(jì)算出需要檢測(cè)的TNF-α mRNA、IL-8m RNA、IL-1βm RNA表達(dá)水平。

2.6 全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù):將待測(cè)標(biāo)本放入試管中，應(yīng)用熒光標(biāo)記法加入單克隆熒光體標(biāo)記，在振蕩器中震蕩均勻，然后放置在25℃～30℃的避光環(huán)境中過(guò)夜保存，最后使用全自動(dòng)血液細(xì)胞儀檢測(cè)，達(dá)到檢測(cè)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的目的。

2.7 肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)FEV1、FEF25-75、PEF值:使用5%的水合氯醛對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉后將小鼠氣管切開(kāi)，置入套管針，并固定。之后將小鼠放置在密閉的箱子中，與肺功能檢測(cè)儀進(jìn)行連接，將通氣參數(shù)設(shè)置為潮氣量6.0 ml/kg，呼吸頻率90次/min，呼吸壓力-8cmH2O，用計(jì)算機(jī)計(jì)算出FEV1、FEF25-75以及PEF值，連續(xù)計(jì)算三次，最終結(jié)果取平均值。

結(jié)果

1 實(shí)驗(yàn)組和空白模型組小鼠TNF-α蛋白、IL-8蛋白、IL-1β蛋白水平觀察 如表1所示，實(shí)驗(yàn)組小鼠TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著低于空白模型組小鼠(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組小鼠IL-8蛋白表達(dá)水平明顯低于空白模型組小鼠，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組小鼠IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著低于空白模型組小鼠(P<0.05)。

表1 兩組小鼠TNF-α蛋白、IL-8蛋白、IL-1β蛋白水平比較(pg/ml)

注：與實(shí)驗(yàn)組相比，*P<0.05

2 實(shí)驗(yàn)組和空白模型組小鼠TNF-α mRNA、IL-8 mRNA、IL-1β mRNA水平觀察 如表2所示，實(shí)驗(yàn)組小鼠TNF-αmRNA水平顯著低于空白模型組小鼠TNF-αmRNA水平(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組小鼠IL-8mRNA水平明顯低于空白模型組小鼠IL-8mRNA水平，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組小鼠IL-1βmRNA水平顯著低于空白模型組小鼠IL-1βmRNA水平(P<0.05)。

表2 兩組小鼠TNF-α mRNA、IL-8 mRNA、IL-1β mRNA水平比較

注：與實(shí)驗(yàn)組相比，*P<0.05

3 實(shí)驗(yàn)組和空白模型組小鼠中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察 如表3所示，實(shí)驗(yàn)組小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)顯著高于空白模型組小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)明顯低于空白模型組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 兩組小鼠中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

注：與實(shí)驗(yàn)組相比，*P<0.05

4 實(shí)驗(yàn)組和空白模型組小鼠肺功能指標(biāo)觀察 如表4所示，實(shí)驗(yàn)組小鼠FEV1明顯高于空白模型組小鼠FEV1，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組小鼠FEF25-75顯著高于空白模型組小鼠FEF25-75(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組小鼠PEF顯著高于空白模型組小鼠PEF(P<0.05)。

表4 兩組小鼠肺功能指標(biāo)比較

注：與實(shí)驗(yàn)組相比，*P<0.05

討論

哮喘與氣道高反應(yīng)性有關(guān)，由中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的異質(zhì)性疾病，屬于氣道慢性炎癥，其主要病理特征表現(xiàn)為氣道重塑及肺功能下降等[3]。哮喘患者通常會(huì)廣泛出現(xiàn)多變的可逆性呼氣氣流受限，從而導(dǎo)致患者反復(fù)出現(xiàn)喘息、氣促、胸悶、咳嗽等癥狀，隨著患病時(shí)間的延長(zhǎng)，其相關(guān)癥狀也會(huì)愈加嚴(yán)重[4]。目前，在臨床治療的過(guò)程中，僅僅是通過(guò)患者的臨床癥狀、體征并不能清楚反映出患者病情的嚴(yán)重程度，增加患者肺功能的檢測(cè)，可以有效觀察哮喘患者的氣流受限程度，對(duì)哮喘患者病情的判斷有重要作用[5]。

TNF-α是醫(yī)學(xué)界目前為止發(fā)現(xiàn)的活性最高的抗腫瘤因子，少量的TNF-α可以殺滅癌細(xì)胞,但是體內(nèi)過(guò)高的TNF-α表達(dá),會(huì)對(duì)人體器官造成損傷，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致器官壞死[6]。IL-8屬于趨化因子家族中的一種細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生。IL-8的主要生物學(xué)活性就是吸引及激活中性粒細(xì)胞，釋放一系列活性產(chǎn)物[7]。IL-8的這些作用可以導(dǎo)致機(jī)體局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生，最終到達(dá)殺菌及細(xì)胞損傷的目的[8]。IL-1β是一種多肽，可以活化T細(xì)胞，促進(jìn)B細(xì)胞增殖，活化中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)內(nèi)皮促凝血活性及內(nèi)皮表面抗原，促進(jìn)成纖維細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞在軟瓊脂中生長(zhǎng)，活化破骨細(xì)胞，抑制膠原合成，刺激膠原分解，促進(jìn)星形細(xì)胞分裂[9]。IL-1β是一種致炎因子，在人體組織的破壞、水腫等多種病理?yè)p傷的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，它可以促進(jìn)β防御素-4的生產(chǎn)，但總體來(lái)說(shuō)，破壞大于防御[10]。TNF-α、LI-8、IL-1β都屬于致炎因子，而哮喘屬于氣道慢性炎癥，因此，TNF-α、LI-8、IL-1β在哮喘患者體內(nèi)均有高表達(dá)，對(duì)哮喘患者的診斷、治療及預(yù)后均有重要作用。本文研究結(jié)果表明，紫蘇子湯可以有效降低哮喘小鼠TNF-α、白細(xì)胞介素-8、白介素-1β水平，從而達(dá)到抑制哮喘小鼠炎癥反應(yīng)的作用。孫莉[11]在研究中表明，經(jīng)過(guò)藥物治療后，哮喘小鼠外周血中的炎性因子表達(dá)水平降低，有效抑制其炎癥反應(yīng)的發(fā)生，與本文研究結(jié)果保持一致。但在其研究中，哮喘小鼠經(jīng)過(guò)藥物治療后，小鼠外周血中TNF-α、LI-8、IL-1β表達(dá)水平下降沒(méi)有本文研究中哮喘小鼠外周血中TNF-α、LI-8、IL-1β表達(dá)水平下降顯著，可能與研究選取樣本數(shù)量有關(guān)，本文研究所選取樣本量多于其研究，最終結(jié)果可能會(huì)更加確切。

中性粒細(xì)胞占人體血液中白細(xì)胞總數(shù)的60%～70%，是白細(xì)胞中數(shù)量最多的一種，主要來(lái)源于骨髓，產(chǎn)生速率高，但存活期較短。中性粒細(xì)胞在血液非特異性細(xì)胞免疫系統(tǒng)中起著重要作用，當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，會(huì)被趨化性物質(zhì)吸引發(fā)至炎癥部位，并吞噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，防止病原微生物在機(jī)體內(nèi)擴(kuò)散[12]。淋巴細(xì)胞由淋巴器官產(chǎn)生，分為T(mén)細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞，是機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分[13]。嗜酸性粒細(xì)胞具有殺菌的作用，是機(jī)體免疫應(yīng)答及過(guò)敏反應(yīng)過(guò)程中的重要細(xì)胞，還可以釋放出顆粒中的內(nèi)容物，從而誘導(dǎo)體積組織損傷，促進(jìn)炎癥進(jìn)展[14]。中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞同屬于白細(xì)胞，并在過(guò)敏性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在哮喘患者體內(nèi)存在異常表達(dá)，通過(guò)監(jiān)測(cè)哮喘患者外周血中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，對(duì)哮喘患者治療及預(yù)后均有重要意義。本文研究結(jié)果表明，紫蘇子湯可以有效升高哮喘小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)，降低哮喘小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定，有抑制氣道炎癥反應(yīng)的作用。本文研究結(jié)果表明，紫蘇子湯可以有效提高哮喘小鼠哮喘小鼠的肺功能指標(biāo)，修復(fù)哮喘小鼠受損肺功能。