端粒重復(fù)序列結(jié)合因子1在子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性研究

郭 靜 于 宵 張 軍

子宮內(nèi)膜癌(carcinoma of endometrium)在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤前三位，占女性生殖道惡性腫瘤的1/3左右，占女性癌癥總數(shù)的8%左右[1-2]。子宮內(nèi)膜癌的具體發(fā)病機(jī)制還不明確，病因包括遺傳、長期雌激素刺激、體質(zhì)因素等[3-4]。人類的端粒是端粒DNA和端粒蛋白的復(fù)合物，其組成是染色體末端的幾千個(gè)雙鏈TTAGGG重復(fù)序列，有利于維護(hù)染色體末端穩(wěn)定性。端粒功能異常將導(dǎo)致細(xì)胞衰老和染色體不穩(wěn)定，也可導(dǎo)致機(jī)體腫瘤發(fā)生[5-6]。端粒酶是1種能將端粒DNA加以延長的酶，其功能是合成染色體端粒的重復(fù)序列，以維持端粒長度的穩(wěn)定性[7]?；A(chǔ)研究表明，端粒長度和結(jié)構(gòu)的維持及端粒酶活性受到端粒結(jié)合蛋白的調(diào)控，正常體細(xì)胞不表達(dá)或僅低表達(dá)端粒酶活性，人類腫瘤細(xì)胞和永生化細(xì)胞系端粒酶活性表達(dá)增高[8-9]。人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(telomeric repeat binding factor 1，TRF1)是端粒長度的負(fù)調(diào)控因子，是最重要的端粒結(jié)合蛋白之一，其也通過干擾端粒酶與染色體末端的結(jié)合，從而對(duì)端粒長度進(jìn)行調(diào)控[10]。TRF1表達(dá)的相關(guān)性研究有助于豐富子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制與臨床特征，從而指導(dǎo)治療[11]。本試驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測TRF1在子宮內(nèi)膜癌組織與癌旁組織中的表達(dá)，探討其與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理特征參數(shù)的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

采用回顧性、總結(jié)研究方法，2013年9月到2017年6月選擇在我院婦產(chǎn)科進(jìn)行手術(shù)診治的子宮內(nèi)膜癌患者120例的癌組織標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受放療、化療及激素治療；有完整的臨床病理資料；病理檢查診斷為子宮內(nèi)膜癌；癌旁組織與離癌組織距離≥3 cm；手術(shù)方式為子宮內(nèi)膜癌分期手術(shù)(廣泛子宮切除術(shù)、雙附件切除及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù))；醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：婦科內(nèi)分泌疾病及生殖道炎癥；妊娠與哺乳期婦女標(biāo)本。

在120例患者的組織標(biāo)本中，年齡45～78歲，平均年齡(65.33±4.21)歲，年齡≥60歲60例；分化程度：高分化80例，中分化20例，低分化20例；臨床分期：Ⅰ期60例，Ⅱ期40例，Ⅲ期20例；病理類型：子宮內(nèi)膜腺癌70例，漿液性乳頭狀腺癌30例，透明細(xì)胞癌20例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例；肌層浸潤50例；形態(tài)：局灶型50例，彌漫型70例。

1.2 免疫組化方法

兔抗人TRF1多克隆抗體(ab1423)來自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB酶底物顯色劑來自廣州深達(dá)生物制品技術(shù)有限公司，Tris-EDTA抗原修復(fù)液購自北京博士德公司，EnvisionTM+加強(qiáng)型免疫組化試劑盒(兔/鼠雙標(biāo))購自DACO公司。

所有患者的癌組織標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本取材后，甲醛固定、石蠟包埋，制成石蠟切片(4 μm厚)。將切片組織37 ℃烤24 h，3 % H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min，抗原修復(fù)后加入一抗，濕盒內(nèi)4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育30 min。DAB顯色，脫水封片后在光學(xué)顯微鏡觀察。取已知陽性組織切片作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 觀察指標(biāo)

TRF1蛋白表達(dá)陽性為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒，染色強(qiáng)度陰性為0分、染色強(qiáng)為3分、染色清晰為2分、染色弱但強(qiáng)于陰性對(duì)照為1分。陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，>60%為3分，31%～60%為2分，10%～30%為1分。上述二種評(píng)分相加0～1分為(-)，2分為(+)，3～4分為(++)，5～6分為(+++)。鏡下順序放大200倍，每張切片隨機(jī)選取10 個(gè)視野，(++)例數(shù)+(+++)例數(shù)/組內(nèi)例數(shù)×100.0%=陽性率，都由病理科醫(yī)院進(jìn)行判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TRF1表達(dá)陽性率對(duì)比

子宮內(nèi)膜癌組織中TRF1表達(dá)陽性率分別為90.8%，癌旁組織為28.3%，對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同組織中TRF1表達(dá)陽性情況

2.2 TRF1表達(dá)與臨床病理特征參數(shù)的相關(guān)性

在子宮內(nèi)膜癌組織中，TRF1的表達(dá)陽性率隨著分化程度的降低、臨床分期的增加、肌層浸潤深度的加深、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移而顯著增高(P<0.05)；TRF1表達(dá)陽性率與患者年齡、大體類型、組織類型無關(guān)(P>0.05)，見表2。

2.3 相關(guān)性分析

在子宮內(nèi)膜癌組織中，Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示：TRF1表達(dá)與臨床分期、肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)性(P<0.05)，與分化程度呈顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，見表3。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是嚴(yán)重危害女性健康的疾病，當(dāng)前在我國的發(fā)病率有上升趨勢，已對(duì)女性的生命和健康造成了嚴(yán)重的威脅[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌患者存在血糖異常，多伴隨有肥胖、高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病[13]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展的確切的分子生物學(xué)機(jī)制還不明確，細(xì)胞增殖與凋亡的失衡是宮內(nèi)膜癌發(fā)生的重要機(jī)制[14]。

表2 TRF1表達(dá)與臨床病理特征參數(shù)的相關(guān)性(例，%)

表3 子宮內(nèi)膜癌組織TRF1表達(dá)的相關(guān)性分析

端粒是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡的重要分子結(jié)構(gòu)之一，端粒、端粒酶及端粒調(diào)節(jié)系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生中起重要作用。有研究顯示接近90 %的惡性腫瘤的端粒酶活性高于正常組織，且增高的程度可能與患者的病情與預(yù)后有關(guān)端粒是存在于真核生物線性染色體末端，端粒的主要作用在于維持染色體的穩(wěn)定與完整，其功能的發(fā)揮主要是依靠端粒長度和端粒結(jié)構(gòu)的保持[15]。端粒酶、端粒結(jié)合蛋白和核糖基轉(zhuǎn)移酶等共同調(diào)控細(xì)胞端粒長度，其中端粒酶是RNA依賴的1種特殊的DNA多聚酶，能以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA序列并添加至染色體末端，從而延長端粒[16]。端粒調(diào)控除端粒酶的作用外，TRF1是另外的1個(gè)端粒結(jié)合蛋白。TRF1分子量約60 kD，由439個(gè)氨基酸組成，過表達(dá)TRF1可導(dǎo)致端粒逐漸和持續(xù)性縮短?；A(chǔ)研究表明當(dāng)TRF1高表達(dá)時(shí)，可保護(hù)端粒末端；而當(dāng)TRF1下降時(shí)，從而降低了對(duì)端粒末端的保護(hù)，導(dǎo)致細(xì)胞具有了永生性[17]。本研究顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中TRF1表達(dá)陽性率分別為90.8%，癌旁組織為28.3%，對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有學(xué)者通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)TRF1蛋白的表達(dá)在慢性肝炎、肝硬化、肝癌患者逐漸增強(qiáng)，特別是在肝癌患者中的TRF1蛋白表現(xiàn)為強(qiáng)陽性[18]。不過也有學(xué)者對(duì)顱腦腫瘤進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)TRF1的表達(dá)陽性率明顯低于正常組織、炎癥及良性腫瘤[19]。

子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生是1個(gè)相對(duì)復(fù)雜的過程，也是多種因素綜合作用導(dǎo)致的病變。端粒酶是維持端粒長度的主要途徑，端粒酶活性又受到端粒結(jié)合蛋白的調(diào)控[20]。TRF1是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物的端粒結(jié)合蛋白，它與端粒雙鏈DNA結(jié)合，可阻止端粒酶與端粒的結(jié)合，改變端粒的結(jié)構(gòu)，從而阻止端粒的延長?；A(chǔ)研究表明TRF1是端粒延長的1個(gè)抑制因子，呈負(fù)反饋調(diào)節(jié)端粒的長度，TRF1變異或缺失會(huì)造成端粒延長并延長細(xì)胞壽命[21]。不同腫瘤組織中的TRF1表達(dá)水平結(jié)果不盡一致，但是均以表達(dá)在細(xì)胞漿為主。本研究顯示，在子宮內(nèi)膜癌組織中，TRF1的表達(dá)陽性率隨著分化程度的降低、臨床分期的增加、肌層浸潤深度的加深、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移而顯著增高(P<0.05)。Spearman等級(jí)相關(guān)分析分析顯示TRF1表達(dá)與臨床分期、肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)性(P<0.05)，與分化程度呈顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。從機(jī)制上分析，如果癌細(xì)胞的端粒比較長，表明具有比較高的端粒酶活性和高TRF1表達(dá)；如果癌細(xì)胞的端粒比較短，表明具有比較低的的端粒酶活性和低TRF1表達(dá)[22]。特別是在細(xì)胞有絲分裂過程中，端粒的長度逐漸縮短，如果細(xì)胞內(nèi)的某些抑癌基因如P53、Rb突變，細(xì)胞周期就會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致端粒繼續(xù)縮短，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[23]。但有如果有部分細(xì)胞在此階段激活端粒酶，染色體形態(tài)得到穩(wěn)定，端粒酶功能恢復(fù)，可導(dǎo)致正常細(xì)胞發(fā)展成為腫瘤細(xì)胞[24]。不過對(duì)于TRF1與子宮內(nèi)膜癌關(guān)系的研究還很有限，具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步分析。

綜上所述，TRF1在子宮內(nèi)膜癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀況，與臨床病理特征有很好的相關(guān)性，可用于指導(dǎo)進(jìn)行臨床診斷與治療。