嫁接體植株中核酸與蛋白質(zhì)的砧穗交流

謝露露，尚慶茂

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所，北京 100081)

嫁接指將一個植株從莖或下胚軸處切斷獲得的芽或枝，與另一個植株帶有根系的部分于切口處貼接，使其愈合并生長成新的嫁接體植株。芽或枝的部分稱為接穗(scion)，帶有根系的部分稱為砧木(stock)，接穗和砧木愈合的部位稱為嫁接結(jié)合部(graft union)。嫁接結(jié)合部具有連通砧木與接穗的維管組織，保證嫁接體植株砧穗兩部分的共同生長和發(fā)育?；蛟S受到自然界中不同植物個體之間融合生長現(xiàn)象的啟迪，在公元2000多年前，我們民眾就已經(jīng)能夠使用嫁接技術(shù)和表型篩選，獲得具有更優(yōu)良性狀的作物[1]。現(xiàn)如今，嫁接已被作為一種常規(guī)手段廣泛應(yīng)用于蔬菜的繁育。較之蔬菜品種單獨種植，優(yōu)良的嫁接體植株具有產(chǎn)量和品質(zhì)提高、生物或非生物脅迫抗性增強、株型優(yōu)化、開花或塊莖化習(xí)性優(yōu)化等增益效果[2-4]。然而并非任意品種之間的嫁接均能獲得理想的性狀改良。在生產(chǎn)應(yīng)用中，經(jīng)常會發(fā)生一個性狀獲得改良的同時另一性狀退化，或是改良效果不明顯等現(xiàn)象。對優(yōu)良砧穗組合的篩選還存在很大的盲目性。為了探討表型變化的規(guī)律，砧穗間物質(zhì)交流的類型和方式被廣泛研究。之前的觀點認為，只有糖類、無機鹽離子、小分子代謝物和內(nèi)源性植物激素可經(jīng)由韌皮部在植物體內(nèi)被系統(tǒng)性地轉(zhuǎn)運，而近10余年的研究證實，大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)和RNA也可在細胞間轉(zhuǎn)運和韌皮部運輸[5-6]。隨后又發(fā)現(xiàn)甚至DNA也可以在嫁接面局部發(fā)生轉(zhuǎn)移[7]。DNA、RNA、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)在砧穗間的交流，很可能對性狀改變起到更為關(guān)鍵的作用。本文結(jié)合最新進展，按照物質(zhì)類型和砧穗間交流方式進行歸納和梳理(表1)。

1 DNA在嫁接面局部的水平轉(zhuǎn)移

近期研究表明，砧穗之間存在基因水平轉(zhuǎn)移(Horizontal gene transfer，HGT)現(xiàn)象。Stegemann及其合作者將核基因組和葉綠體基因組分別標(biāo)記抗性基因和熒光標(biāo)識的2個煙草轉(zhuǎn)基因株系以斜切45°的方式嫁接，待嫁接體形成后在嫁接結(jié)合部連續(xù)橫切，再將由此獲得的莖組織薄片在含有2種抗生素選擇壓力的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)。培養(yǎng)皿上分化出來的植株兼具2種抗性基因和2種熒光標(biāo)識，而遠離嫁接部位的莖組織薄片則不能分化出植株，這個現(xiàn)象說明了砧穗嫁接面附近區(qū)域發(fā)生的基因水平轉(zhuǎn)移事件[7]。隨后他們又將標(biāo)記葉綠體基因組的煙草(Nicotianatabacum)作為砧木，標(biāo)記核基因組的煙草屬另外2個種N.glauca和N.benthamiana作為接穗，同樣是利用嫁接結(jié)合部切片和雙抗選擇壓下的組織培養(yǎng)獲得抗性植株。結(jié)果顯示，該植株的表型在幼苗期和成體期均與接穗物種的表型幾乎相同。DNA分子標(biāo)記和特征片段測序結(jié)果表明，雙抗培養(yǎng)基篩選出來的植株捕獲了來自砧木的完整葉綠體基因組[8]。為了繼續(xù)驗證核基因組是否也有轉(zhuǎn)移，將N.tabacum(核型2n=48)2個株系的核基因組分別標(biāo)記，獲得了包含2套核基因組標(biāo)記的核基因轉(zhuǎn)移(Nuclear gene transfer，NGT)株系，該NGT株系可以自交形成種子，自交后代染色體數(shù)目多為96，且表型變異很大。有趣的是，如果將N.tabacum與染色體數(shù)目不同的N.glauca(核型2n=24)嫁接獲得NGT株系后，則自交后代的染色體數(shù)目穩(wěn)定在72條，且群體內(nèi)表型一致，抗性基因呈現(xiàn)孟德爾分離比。嫁接部位由疑似細胞融合(Cytomixis)機制產(chǎn)生的異源多倍體具有無繁殖障礙和穩(wěn)定遺傳等特點，表明經(jīng)由基因水平轉(zhuǎn)移介導(dǎo)的非有性(Asexual)途徑能夠形成嫁接雜合體(Graft hybrid)的事實[9]。

由以上試驗可知，砧穗間的DNA交流形式既包括完整葉綠體基因組，又包括核基因組。然而交流僅發(fā)生在嫁接面部位，即使有從嫁接結(jié)合部小概率長成的具有嫁接雜合體性質(zhì)的芽或側(cè)枝，嫁接體植株上絕大部分組織仍然不具備從嫁接搭檔那里捕獲的DNA。盡管如此，卻不能完全排除DNA轉(zhuǎn)移對表型的影響。研究表明，基因水平轉(zhuǎn)移普遍存在于陸地植物的表型演化歷程，植物基因組中保留的異源基因在一些基本功能中發(fā)揮作用，如木質(zhì)部形成、植物防御、氮循環(huán)以及淀粉、多胺、植物激素和谷胱甘肽等的生物合成等[10]。而嫁接結(jié)合部作為砧木和接穗在形態(tài)和生理上的緩沖區(qū)，DNA所承載遺傳信息的局部轉(zhuǎn)移會對砧穗雙方的表型產(chǎn)生怎樣的影響，還需要進一步證實。

2 蛋白質(zhì)在砧穗間的長距離運輸

遍布植物體的韌皮部篩管是由首尾相接的篩分子(Sieve elements，SE)-伴胞(Companion cell，CC)復(fù)合體構(gòu)成。篩管中的韌皮部運輸流(Phloem translocation stream)，是物質(zhì)在植物體內(nèi)各個組織間長距離系統(tǒng)性運輸(Long-distance systemic transportation)的唯一途徑。韌皮部的SE和CC連接處，有特化的孔間單元(Pore plasmodesmal units，PPUs)結(jié)構(gòu)。由于這種結(jié)構(gòu)的存在，胞間連絲的尺寸排阻極限(Size exclusion limit，SEL)可達到遠超普通細胞間SEL的程度，為1 ku以上，最大為67 ku[11]。這樣的SEL足夠蛋白質(zhì)和分子質(zhì)量較小的RNA通過[5]?？梢栽陧g皮部運輸?shù)奈镔|(zhì)，當(dāng)砧穗正常愈合后，均可以在砧穗間穿梭。利用嫁接系統(tǒng)完成的長距離運輸試驗，為大分子物質(zhì)的砧穗間穿梭提供了大量證據(jù)。

從韌皮部汁液(Phloem sap)中鑒定出來的蛋白質(zhì)數(shù)量眾多[11]。綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)和所有分子質(zhì)量低于SEL閾值的GFP融合蛋白均能夠通過CC-SE邊界[5,12]。說明蛋白質(zhì)在進入韌皮部時的方式是非選擇性的。另外有證據(jù)表明，較之內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錨定核糖體上翻譯出的蛋白質(zhì)，胞質(zhì)游離核糖體上翻譯出來的蛋白質(zhì)更容易進入SE。而編碼亞細胞定位信號的多肽鏈不足以指導(dǎo)蛋白質(zhì)的韌皮部運輸。這說明，韌皮部蛋白質(zhì)中很大一部分是由于非特異性流失而造成的[13]。

韌皮部運輸流中的蛋白質(zhì)至少具有2種功能形式：信號傳遞和輔助運輸。起信號傳遞作用的蛋白在植物體內(nèi)的長距離運輸，履行系統(tǒng)性防御或者發(fā)育信號傳遞的功能。例如成花素(Florigen)被認為是光信號接收部位和莖頂端開花效應(yīng)部位之間的信號傳遞分子。在南瓜屬(Cucubita)2個種的異源嫁接試驗中，成花素的身份被確定為FT(Flowering locus T)蛋白。將長日照條件下生長的短日照植物白籽南瓜(C.moschata)與已經(jīng)開花的印度南瓜(C.maxima)嫁接，則白籽南瓜接穗被誘導(dǎo)開花，伴隨接穗韌皮部汁液中大量存在的Cm-FTL1(Flowering locus T-like1)和Cm-FTL2蛋白，而非它們的mRNA[14]。FT蛋白不僅是誘導(dǎo)開花的信號蛋白，還能夠誘導(dǎo)馬鈴薯(Solanumtuberosum)地下莖的塊莖化(Tuberization)。如果將水稻的FT同源基因Hd3a在馬鈴薯中表達，并將轉(zhuǎn)基因植株作為接穗與野生型嫁接，則能夠誘導(dǎo)原本在長日照條件下生長不形成塊莖的野生型砧木形成塊莖[15]。另外，親環(huán)蛋白(Cyclophilin)也代表了一類可長距離運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)信號分子。在番茄(Solanumlycopesicum)中,將野生型接穗與親環(huán)蛋白SlCyp1突變的砧木嫁接后，可以恢復(fù)突變體的根系發(fā)育和對生長素的敏感性[16]。

在韌皮部中還鑒定到一些行駛輔助運輸功能的蛋白質(zhì)，被認為是大分子物質(zhì)系統(tǒng)性長距離運輸機制的組成部分。這類蛋白結(jié)合RNA分子，同時能夠增大胞間連絲(Plasmodesmata，PD)的CEL，從而輔助RNA的選擇性運輸[5]。如印度南瓜中的CmPP16(Phloem protein 16)，與病毒移動蛋白(Movement proteins，MPs)同源，存在于SE中，能結(jié)合包括自身mRNA在內(nèi)的若干種RNA分子[17]。編碼細胞色素b5還原酶(Cytochrome b5 reductase，Cb5R)的CmPP36也結(jié)合RNA，但在韌皮部汁液中鑒定到的CmPP36蛋白，是其完整編碼序列去除N端一段跨膜序列后的形態(tài)，人為去除N端序列后，可以實現(xiàn)CmPP36蛋白的韌皮部轉(zhuǎn)運，從而推測蛋白質(zhì)進入韌皮部時可能存在蛋白質(zhì)水解過程[18]。此外，韌皮部凝集素(Lectin)類蛋白CmmPP2和CmmLec17在CC中合成，經(jīng)PD轉(zhuǎn)運至SE，能夠結(jié)合韌皮部RNA和病毒RNA。甜瓜(Cucumismelo)砧木和印度南瓜接穗嫁接后，甜瓜CmmLec17蛋白在嫁接后25 d在印度南瓜接穗中被檢測到[19]。另一類RNA結(jié)合蛋白，PTB(Polypyrimidine tract-binding)類蛋白傾向于結(jié)合在RNA的尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)富集區(qū)域，介導(dǎo)RNA的運輸，如印度南瓜CmRBP50(RNA binding protein 50)蛋白和自身轉(zhuǎn)錄本的運輸[20]、馬鈴薯中的StPTB1/6 介導(dǎo)StBEL5(BEL1-like 5)轉(zhuǎn)錄本的運輸[21]、杜梨(Pyrusbetulaefolia)中的PbPTB3蛋白介導(dǎo)PbWoxT1(Wox transport 1)轉(zhuǎn)錄本的運輸[22]。

3 信使RNA在砧穗間的長距離運輸

在韌皮部汁液中發(fā)現(xiàn)可遷移的mRNA(Transmissible mRNAs)，曾讓人們感到出乎意料[6]。通過葫蘆科和茄科物種的異源嫁接試驗，發(fā)現(xiàn)多個可遷移mRNA，如CmNACP(NAC domain protein)從南瓜砧木遷移至黃瓜(Cucumissativus)接穗，參與黃瓜頂端分生組織的發(fā)育調(diào)控[6]。從番茄的Me(Mouseear)自然突變體中遷移出的過量LeT6(KNOTTED-1-like homeobox)基因轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)致番茄和馬鈴薯接穗的葉片形態(tài)發(fā)生明顯改變[23-24]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)gai-1(gibberellicacidinsensitive1)突變體中的GAI基因缺失了DELLA結(jié)構(gòu)域序列，因而存在GA信號途徑的異常。將帶有ΔDELLA-gai基因的擬南芥或者遺傳轉(zhuǎn)化Cmgaip基因的番茄作為砧木，與各自的野生型植株進行嫁接，均導(dǎo)致野生型接穗呈現(xiàn)植株矮小的赤霉素缺陷表型，gai轉(zhuǎn)錄本的長距離運輸是其內(nèi)在原因[25]。在擬南芥和本氏煙草(Nicotianabenthamiana)的遠緣嫁接試驗中，擬南芥生長素響應(yīng)蛋白(Indoleacetic acid-inducible protein)IAA18/28轉(zhuǎn)錄本在本氏煙草接穗中被檢測到。由于此類蛋白定位于根系，被認為與根系形態(tài)的發(fā)育調(diào)控有關(guān)[26]。以上均是mRNA從砧木運輸至接穗的例證，關(guān)于塊莖化誘導(dǎo)的試驗表明，mRNA同樣可以由接穗運輸至砧木。例如在馬鈴薯中過表達StBEL5(BEL1-like 5)的接穗能夠誘導(dǎo)砧木的塊莖形成[27]。

除了已經(jīng)被驗證功能的可遷移mRNA，最近幾項有關(guān)擬南芥、葡萄(Vitisvinifera)、葫蘆科異源嫁接系統(tǒng)的研究，利用高通量測序技術(shù)從組學(xué)角度闡釋了mRNA的遷移[28-30]。將擬南芥2種生態(tài)型互相嫁接，以單核苷酸位點多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)為標(biāo)簽來區(qū)分不同來源的轉(zhuǎn)錄本，篩選出數(shù)以千計的可遷移mRNA。可遷移mRNA普遍具有明確的遷移方向和目標(biāo)組織[28]。蛋白質(zhì)組還顯示，可遷移mRNA是在運至目標(biāo)組織之后才被翻譯為蛋白質(zhì)[28]。使用黃瓜與西瓜(Citrulluslanatus)的異源嫁接體系，并加以營養(yǎng)脅迫處理后，可遷移mRNA在嫁接搭檔不同組織間的重復(fù)性很低，再次說明源組織中的mRNA被有針對性地運往特定的庫組織[30]。可遷移mRNA的類群和遷移方式與嫁接體所處的發(fā)育階段和外部環(huán)境密不可分。比如成體期中的可遷移mRNA數(shù)量比幼體期中的少得多[29]。同是營養(yǎng)缺乏脅迫，缺氮和缺磷時鑒定到的可遷移mRNA的種類和數(shù)量較之全營養(yǎng)條件明顯不同[28]。磷短期缺乏處理(24 h)后，可遷移mRNA中富集有已知直接參與磷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和同化過程的轉(zhuǎn)錄本，如VPT(Vacuolar phosphate transporter 1)、PHO2(Phosphate 2)、CAX3(Cation exchanger 3)等，以及脅迫反應(yīng)通用的一些編碼各類激素受體和信號通路的轉(zhuǎn)錄本[30]。

mRNA的運輸除了需要起輔助運輸作用的蛋白質(zhì)，還與mRNA自身的序列和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。在擬南芥中，僅是GFP的轉(zhuǎn)錄本不能進入韌皮部，而當(dāng)GFP與GAI的序列融合時，則能被長距離運輸。推測這與GAI上帶有的特征性基序(motif)和二級結(jié)構(gòu)有關(guān)[31]。在馬鈴薯中，韌皮部遷移轉(zhuǎn)錄本StBEL5的3′UTR區(qū)域?qū)S持mRNA的穩(wěn)定性和向根運輸是必要的[32]。進一步研究表明，較高比例的可遷移mRNA在編碼區(qū)和UTR區(qū)具有類似tRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(tRNA-like structure，TLS)，這種TLS結(jié)構(gòu)負責(zé)驅(qū)動mRNA的遷移[33]。另外，RNA序列上多聚UC(Uracil cytosine)元件的存在有利于PTB類RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合[21]。

4 小RNA在砧穗間的長距離運輸

在mRNA被證實經(jīng)韌皮部運輸之后，小RNA群體的長距離運輸也被證實。從韌皮部汁液中檢測到的小RNA(sRNA)包括小干擾RNA(Short interfering RNA，siRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)[34]。siRNA和miRNA是由雙鏈RNA經(jīng)Dicer酶家族成員切割而形成的長度為21～26 nt單鏈RNA[35-36]。砧穗完全愈合后sRNA可經(jīng)由韌皮部在嫁接結(jié)合部上下自由移動?？梢苿拥膕RNA以結(jié)合并裂解mRNA的形式使嫁接搭檔的基因被轉(zhuǎn)錄后沉默(Post-transcriptional gene silencing，PTGS)，或是以RNA介導(dǎo)的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation，RDDM)途徑改變DNA的表觀遺傳修飾，使基因被轉(zhuǎn)錄沉默(Transcriptional gene silencing，TGS)[37]。

轉(zhuǎn)基因美洲南瓜(Cucubitapepo)作為砧木，野生型黃瓜作為接穗的嫁接中，砧木中的CP(coatprotein)基因特異性siRNA能夠通過長距離運輸沉默接穗中的CP轉(zhuǎn)錄本[34]。將分別具有GFP特異性siRNA沉默信號和非沉默的2個GFP轉(zhuǎn)基因煙草株系正反嫁接，結(jié)合GFP熒光和韌皮部同位素示蹤，顯示出siRNA介導(dǎo)的沉默信號跟隨韌皮部運輸流從源(Source)組織被穩(wěn)定運往庫(Sink)組織[38]。利用擬南芥的嫁接試驗證實，24 nt siRNA可介導(dǎo)受體細胞中全基因組的DNA甲基化[39-40]。由于長距離運輸?shù)膕iRNA同樣會出現(xiàn)在繁殖器官的頂端生長點或花粉細胞中，誘導(dǎo)DNA表觀遺傳層面的改變，因此有可能將嫁接體的性狀遺傳至后代個體[41]。

miRNA通常以負調(diào)控因子身份作用于轉(zhuǎn)錄因子，參與發(fā)育進程或環(huán)境響應(yīng)的調(diào)控。例如，miR156和miR172的系統(tǒng)性運輸調(diào)控植物從幼體到成體的發(fā)育轉(zhuǎn)換。在馬鈴薯中，過表達miR172的植株表現(xiàn)出花期提前和塊根形成提前，miR172過表達接穗與野生型砧木雜交，能夠誘導(dǎo)野生型砧木的塊根形成量增多[42]。過表達miR156的植株表現(xiàn)為植株構(gòu)型改變和塊根產(chǎn)量降低，miR156過表達接穗和野生型砧木嫁接后，砧木的葉片形態(tài)發(fā)生改變[43]。油菜(Brassicanapus)、印度南瓜中的研究結(jié)果顯示，當(dāng)植株面臨磷缺乏脅迫時，韌皮部汁液中miR399大量積累，通過轉(zhuǎn)錄后沉默機制抑制磷吸收負調(diào)因子PHO2(Phosphate 2)，提高植物對磷的吸收[44-45]。擬南芥微嫁接試驗顯示miR399過表達接穗能夠誘導(dǎo)野生型根系中產(chǎn)生大量成熟態(tài)miR399，如果砧穗互換，則在接穗中檢測不到或僅檢測出痕量的成熟態(tài)miR399[45]。在受到硫缺乏脅迫時的油菜韌皮部汁液中，miR395和miR171均明顯上調(diào)[46]。miR399和miR395在植物面臨營養(yǎng)脅迫時，從接穗傳遞至砧木，而不是相反方向，miR171則不移動[46]。從而表明miRNA不僅可以在砧穗間長距離運輸，改變嫁接搭檔的表型和生理狀況，而且移動具有明顯的方向性。

即使sRNA的分子量很小，它們在細胞間并不能自由擴散，而是需要特異性sRNA結(jié)合蛋白(Small RNA binding protein，SRPB)的輔助[34]。sRNA在源組織中合成后，被運往庫組織的運輸形式可以是初級形態(tài)，也可以是成熟形態(tài)[40]。

5 小 結(jié)

綜上所述，DNA的交換局限于嫁接面，目前沒有證據(jù)表明它們對接穗或砧木的整體表型產(chǎn)生影響；蛋白質(zhì)的運輸則更多起到輔助作用，即使作為信號分子存在，也如同小分子代謝物或內(nèi)源性植物激素的作用，并不攜帶遺傳信息。而RNA在砧穗間的互作是非常值得關(guān)注的。mRNA的大規(guī)模系統(tǒng)性運輸，以及sRNA的遠程調(diào)控和表觀遺傳修飾作用，對嫁接體植株的表型變異影響顯著。大分子物質(zhì)在韌皮部運輸流中的長距離運輸，尤其是RNA的運輸，及其所引起的表觀遺傳層面的變化，應(yīng)該受到更加廣泛的關(guān)注。期待該領(lǐng)域后續(xù)的研究和進展，為砧穗組合效果和嫁接體生長發(fā)育的精準(zhǔn)預(yù)測開辟捷徑，從而深入挖掘嫁接技術(shù)的潛力，使之更好地促進農(nóng)業(yè)發(fā)展和農(nóng)民收益。