蘆薈凝膠對深Ⅱ度燙傷大鼠創(chuàng)面愈合及EGF、 bFGF 表達(dá)的影響

劉川玉， 唐建紅， 何 潔， 肖勝軍， 蔡蔣帆

（1. 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 廣西 桂林541001； 2. 桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院， 廣西 桂林541199）

蘆薈屬百合科植物， 其種類達(dá)幾百種， 但可供藥用只有十余種， 以庫拉索蘆薈、 斑紋蘆薈、 好望角蘆薈最常用。該植物含有多種有效成分及藥理作用， 民間廣泛用于治療各種疾病， 素有“百藥箱” 之美稱， 主要有糖類、 氨基酸、 維生素、 礦物質(zhì)、 有機(jī)酸活性酶、 蘆薈大黃素、 蘆薈苦素、 蘆薈丁等［1］， 其中蘆薈多糖是主要活性成分， 具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合及組織修復(fù)、 減少疤痕形成、 保護(hù)黏膜、 抑菌抗炎、 抗病毒、 抗癌、 抗輻射［2］、 增強(qiáng)免疫力［3］、 降低血糖［4］等作用， 對各種組織創(chuàng)傷（尤其是燒燙傷） 療效顯著。

課題組前期研究表明， 將鮮庫拉索蘆薈研制成凝膠后可保持蘆薈多糖含有量［5］， 并明確了其促進(jìn)創(chuàng)面愈合、 減少疤痕形成的作用［6］。 本實(shí)驗(yàn)將蘆薈凝膠外敷大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面， 并檢測燙傷組織修復(fù)過程中表皮生長因子（EGF）、 堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF） 表達(dá)， 以闡明其促進(jìn)傷口愈合的相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD 大鼠80 只， 雌雄各半， 體質(zhì)量（200±20）g， 由桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物室提供， 生產(chǎn)許可證號SCXK （桂） 2013-0001， 動(dòng)物使用及處理方法嚴(yán)格按照桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的要求進(jìn)行。

1.2 儀器 電子天平； 細(xì)胞破碎儀； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀； -80 ℃超低溫冰箱。

1.3 試藥 蘆薈凝膠采用鮮庫拉索蘆薈（桂林醫(yī)學(xué)院藥用植物園） 制備［7］， 方法為取新鮮葉適量， 洗凈， 瀝干， 去皮， 取出凝膠條， 攪拌成均勻葉汁， 超聲破碎10 min， 過濾， 稀釋， 蘆薈液-75%乙醇（1 ∶3）， 將所得溶液于80 ℃中水浴30 min， 0.5%活性炭脫色， 減壓抽濾， 濾液濃縮至原體積的1／10， 加入0.2% ～0.5% 亞硫酸鈉， 即得。 成品質(zhì)地均勻細(xì)膩， 為乳白色透明的混懸稠厚液體， 并對其性狀、 離心實(shí)驗(yàn)、 酸堿度、 微生物限度、 多糖含有量、 穩(wěn)定性等質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行控制。

1.4 抗體及免疫組化試劑盒 EGF 抗體（sc-1343， 1 ∶

100 稀釋）、 bFGF 抗體（sc-79， 1 ∶100 稀釋） 均購自美國Santa Cruz 公司； 二抗及免疫組化試劑盒（SP-9001、 ZB-2306） 均購自南京森貝伽生物科技有限公司。

2 方法

2.1 模型建立 采用水浴烙鐵法致燙傷［8］。 固定大鼠四肢， 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉， 背部靠頭頸處脫毛并消毒后， 將開水浴中煮沸15 min、 橫斷面約為2 cm×1 cm 的鐵棒取出后迅速用紗布擦干， 一端緊貼大鼠背部皮膚持續(xù)7 s， 力度以鐵棒橫斷面緊貼皮膚不形成皮膚凹陷為準(zhǔn)， 使大鼠裸露的背部產(chǎn)生約10%的燙傷， 創(chuàng)面經(jīng)病理證實(shí)為深Ⅱ度燙傷， 然后立即腹腔注射乳酸林格氏液5 mL 抗休克，由于背部燙傷部位大鼠未能舔食觸及和搔抓， 故將燙傷創(chuàng)面開放以利于隨時(shí)觀察其愈合或感染情況。 將大鼠置于25 ℃室溫、 50%相對濕度環(huán)境中， 分籠飼養(yǎng)， 自由攝食、飲水。

2.2 分組及給藥 將80 只大鼠隨機(jī)分成給藥組和對照組，每組40 只。 給藥組用蘆薈凝膠外敷燙傷創(chuàng)面， 厚度1 mm，4 次／d； 由于蘆薈凝膠為單方制劑， 沒有使用任何凝膠基質(zhì)， 故對照組用生理鹽水外敷燙傷創(chuàng)面， 4 次／d， 用藥后各組創(chuàng)面保持開放， 分籠飼養(yǎng)。 每次給藥前， 生理鹽水清洗創(chuàng)面以除去殘留受試物， 連續(xù)用藥24 d， 燙傷創(chuàng)面如有感染時(shí)用抗生素外涂（為不影響受試物吸收， 用抗生素時(shí)間與給藥時(shí)間的間隔在4 h 以上）， 2 次／d。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 創(chuàng)面愈合率 燙傷后2、 6、 10、 14、 24 d， 將創(chuàng)面描記在半透明紙上， 以此為模板將質(zhì)地均勻的硬紙片剪成同樣大小來表示創(chuàng)面面積， 計(jì)算創(chuàng)面愈合率， 公式為創(chuàng)面愈合率＝ ［（開始燙傷面積-未愈合創(chuàng)面面積） ／開始燙傷面積］ ×100%。

2.3.2 EGF、 bFGF 表達(dá) 測量創(chuàng)面愈合面積后， 手術(shù)剝離大鼠背部燙傷創(chuàng)面皮膚組織， 福爾馬林固定， 常規(guī)制成石蠟切片， HE 染色觀察皮膚病理變化， 免疫組化檢測組織中EGF、 bFGF 表達(dá)。 抗原修復(fù)采用檸檬酸鹽熱修復(fù)法， 免疫組化具體步驟按相關(guān)說明書進(jìn)行。 EGF、 bFGF 以細(xì)胞黃染為陽性， 從每張免疫組化染色切片中隨機(jī)選取5 個(gè)視野，輸入Q550CW 圖像信號采集與分析系統(tǒng)測定陽性細(xì)胞的平均灰度值， 以此反映傷口局部兩者表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理， 計(jì)量資料以（ˉ±s）表示， 計(jì)數(shù)資料以百分率表示， 配對資料用t 檢驗(yàn)， 組間差異用單因素方差分析， 等級資料用Radit 分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 蘆薈凝膠對大鼠創(chuàng)面愈合率的影響 與對照組比較，給藥組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著升高（P＜0.05）， 隨著時(shí)間延長兩組差異更明顯。 見表1。

表1 蘆薈凝膠對大鼠創(chuàng)面愈合率的影響（%， ±s， n＝40）

表1 蘆薈凝膠對大鼠創(chuàng)面愈合率的影響（%， ±s， n＝40）

注：與對照組比較，?P＜0.05

組別 2 d 6 d 10 d 14 d 24 d對照組 10.12±3.10 16.23±4.11 24.36±3.62 34.35±4.26 51.21±4.61給藥組 15.25±3.21? 26.36±4.35? 38.16±4.12? 55.52±3.14? 88.56±5.02?

3.2 蘆薈凝膠對大鼠EGF 表達(dá)的影響 EGF 表達(dá)于損傷交界處表皮細(xì)胞、 真皮成纖維細(xì)胞、 毛囊上皮細(xì)胞、 血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖1）； 與對照組比較， 給藥組大鼠EGF 表達(dá)顯著高于對照組（P＜0.05）， 而且兩組均在第6 天到達(dá)高峰， 之后逐漸下調(diào)。 見表2 （以灰度值表示）。

圖1 蘆薈凝膠對大鼠EGF 表達(dá)的影響（第6 天， ×400）

表2 蘆薈凝膠對大鼠EGF 表達(dá)的影響（±s， n＝40）

表2 蘆薈凝膠對大鼠EGF 表達(dá)的影響（±s， n＝40）

注： 與對照組比較，?P＜0.05

組別 2 d 6 d 10 d 14 d 24 d對照組 101.08±10.84 110.34±11.41 99.67±9.76 78.31±8.33 70.32±7.64給藥組 132.56±12.15? 153.12±14.76? 132.23±13.43? 98.67±9.36? 87.78±8.21?

3.3 蘆薈凝膠對大鼠bFGF 表達(dá)的影響 bFGF 表達(dá)于損傷交界血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞（圖2）； 與對照組比較， 給藥組大鼠bFGF 表達(dá)在愈合早期（第2、 6 天） 顯著升高 （P ＜0.05）， 愈合中期 （第10 天） 相 當(dāng) （P ＞0.05）， 愈合后期 （第14、 24 天） 反而顯著降低 （P ＜0.05）。 見表3 （以灰度值表示）。

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療燙傷的原則是在促進(jìn)創(chuàng)面愈合的同時(shí)，盡可能減少疤痕形成。 蘆薈具有抗菌、 消炎、 生肌、 促進(jìn)傷口愈合、 減少疤痕形成等多種藥理作用， 研究證實(shí)， 蘆薈汁能促進(jìn)大鼠深Ⅱ度燒傷皮膚愈合［9］， 并能減少創(chuàng)面愈合后疤痕形成。

圖2 蘆薈凝膠對bFGF 表達(dá)的影響（第6 天， ×400）

皮膚創(chuàng)傷愈合過程由表皮細(xì)胞分裂增殖、 纖維母細(xì)胞增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)來完成， 其中包括各種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子參與愈合過程。 燙傷皮膚的表皮修復(fù)依賴于周圍正常表皮細(xì)胞分裂增殖覆蓋損傷部位， 而表皮細(xì)胞的分裂增殖依賴于表皮生長因子， 其中EGF 是表皮細(xì)胞最主要的有絲分裂原。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 給藥組、 對照組EGF 蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞分布一致， 均主要為損傷交界處表皮細(xì)胞、 真皮成纖維細(xì)胞、 毛囊上皮細(xì)胞、 血管內(nèi)皮細(xì)胞， 這些部位是創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞的增殖活躍部位， 與文獻(xiàn)［10］ 報(bào)道一致， 同時(shí)兩組創(chuàng)面EGF 表達(dá)均于燙傷后第6 天達(dá)到高峰，以給藥組更顯著， 表明蘆薈凝膠外敷可促進(jìn)其合成和分泌。由此推測， 蘆薈具有解毒、 消炎、 減輕組織水腫等功效，故減少損傷因子對EGF 分泌相關(guān)細(xì)胞（尤其是表皮細(xì)胞）有明顯抑制作用， 從而增強(qiáng)其分泌相關(guān)細(xì)胞因子的能力。此外， 有研究發(fā)現(xiàn)蘆薈粗多糖能促進(jìn)人表皮細(xì)胞體外分泌EGF［11］， 而且通過影響表皮細(xì)胞的DNA 合成及細(xì)胞周期來促進(jìn)細(xì)胞增殖［12］， 故蘆薈還可能通過依賴或非依賴EGF機(jī)制來促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖和燙傷皮膚愈合。

表3 蘆薈凝膠對bFGF 表達(dá)的影響（±s， n＝40）

表3 蘆薈凝膠對bFGF 表達(dá)的影響（±s， n＝40）

注： 與對照組比較，?P＜0.05

組別 2 d 6 d 10 d 14 d 24 d對照組 99.05±10.12 108.13±11.31 107.21±9.21 88.31±8.01 50.08±7.24給藥組 125.17±11.07? 143.12±14.15? 112.23±13.08 64.67±9.06? 32.05±4.42?

bFGF 是纖維母細(xì)胞生長因子家族成員之一， 能促進(jìn)細(xì)胞主要是纖維母細(xì)胞的分裂、 增殖， 促進(jìn)血管生成， 因而在創(chuàng)傷愈合中起到重要作用［13］。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 在愈合早期（第2、 6 天） 蘆薈凝膠外敷能促進(jìn)bFGF 分泌， 而在愈合晚期（第14、 24 天） 反而下降， 這是因?yàn)樵缙趽p傷修復(fù)是通過肉芽組織， 即新生毛細(xì)血管和纖維母細(xì)胞進(jìn)行； 晚期肉芽組織中毛細(xì)血管成熟并減少， 纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維細(xì)胞并產(chǎn)生膠原纖維， 即蘆薈凝膠在早期促進(jìn)組織修復(fù)，而在晚期由于修復(fù)較快而導(dǎo)致肉芽組織老化也較快， 故bFGF 表達(dá)下調(diào)， 其中蘆薈多糖可能加速肉芽組織形成和老化而減少疤痕形成。

綜上所述， 蘆薈凝膠能促進(jìn)深Ⅱ度燙傷大鼠EGF、bFGF 表達(dá)， 從而加速創(chuàng)面皮膚愈合， 本實(shí)驗(yàn)可為該制劑在燒燙傷方面應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。