姜制附子對(duì)大鼠機(jī)體熱性的影響

童恒力， 鐘凌云， 祝 婧

（江西中醫(yī)藥大學(xué)， 江西 南昌330004）

宋代《博濟(jì)方》 中有記載姜制附子的方法， 云“去皮臍， 生切作四塊， 用生姜半觔， 用水一碗同煮附子， 汁盡為度， 取附子焙干為末”； 《類編朱氏極驗(yàn)醫(yī)方》 也提出“大附子， 慎火， 炮裂去皮， 切作拾片， 用生姜， 米泔淹一宿， 去姜， 薄切焙干”； 樟幫的臨江片采用生姜片拌蒸、 經(jīng)米泔水漂洗過的附子， 而建昌幫的陰附片則使用生姜汁悶潤(rùn)附子后蒸制。 附子性大熱、 有毒， 傳統(tǒng)中醫(yī)理論有“附子無姜不熱” 的說法， 而且有研究表明姜辣素對(duì)其毒性成分有抑制作用［1］， 故姜制附子有一定的理論基礎(chǔ)。

舌診是中醫(yī)的一種辨證方法， 可通過舌像辨別機(jī)體的寒熱虛實(shí)狀態(tài)， 以及氣血津液的盛衰， 現(xiàn)代科學(xué)也證實(shí)舌像變化可反映機(jī)體的健康狀態(tài)［2］， 目前提倡通過實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物所表現(xiàn)出的宏觀表征來辨析中醫(yī)證候， 從而能更好地從中醫(yī)思路出發(fā)開展研究［3］。

Na＋-K＋-ATP 酶是一種體內(nèi)廣泛存在的細(xì)胞膜蛋白， 其消耗很大一部分機(jī)體新陳代謝的能量來維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡， 以及調(diào)節(jié)一些能量物質(zhì)的運(yùn)輸［4-5］； 前列腺素E2（PGE2） 是具有多種生理功能的活性物質(zhì)， 其與EP3 受體結(jié)合是發(fā)揮致熱作用的基礎(chǔ)［6］； 腎上腺素（EPI） 能使機(jī)體呼吸加深加快（攝入大量氧氣）， 加速心跳與血液流動(dòng)，為機(jī)體活動(dòng)提供更多能量。 本實(shí)驗(yàn)通過上述能量相關(guān)指標(biāo)研究姜制對(duì)附子藥性變化的影響， 為臨床使用相關(guān)飲片提供一定參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD 雄性大鼠， 體質(zhì)量（200±20） g， 共84 只（其中28 只作預(yù)實(shí)驗(yàn)用）， 購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司， 動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （魯） 20140007， 檢疫后備用。

1.2 藥材 鹽附子購(gòu)自四川江油， 生姜購(gòu)自廣東高明區(qū)，母姜購(gòu)自四川犍為， 均由江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室葛菲教授鑒定為正品。

1.3 姜制品

1.3.1 干姜片 犍為母姜切片（約0.3 cm 厚）， 低溫烘干， 即得。

1.3.2 生姜榨汁 取生姜洗凈切片， 加水反復(fù)壓榨4 次，合并， 過濾， 低溫濃縮。

1.3.3 生姜煎汁 取生姜洗凈切片， 加水煎煮3 次， 合并汁液， 過濾， 濃縮。

1.3.4 干姜煎汁 取干姜煎煮3 次， 合并汁液， 過濾，濃縮。

1.3.5 干姜片（生姜片） 拌蒸附子 將附子洗去鹽分，冷水漂洗數(shù)天并經(jīng)常換水， 除去外皮， 切片， 米泔水漂洗數(shù)天， 取適量生姜片（干姜片） 拌勻， 置于蒸籠中蒸制，低溫烘干， 即得。

1.3.6 干姜煎汁（生姜煎汁、 生姜榨汁） 拌蒸附子 將附子洗去鹽分， 冷水漂洗數(shù)天并經(jīng)常換水， 烘干， 加入適量干姜煎汁（生姜煎汁、 生姜榨汁）， 悶潤(rùn)后置于蒸籠中蒸制， 切成薄片， 低溫烘干， 即得。

1.4 煎劑 生附子加10 倍量水浸泡45 min， 沸騰后第1次煎煮30 min， 第2 次加6 倍量水， 沸騰后煎煮30 min，紗布濾過， 合并煎液， 減壓濃縮后置于冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩Ｍㄖ苽浣聘阶蛹鍎?/p>

1.5 試藥及儀器 25%戊二醛溶液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司， 100 mL， 批號(hào)20131217）； 水合氯醛（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司， 250 g， 批號(hào)20150703）； 超微量ATP（Na＋K＋） 測(cè) 試 盒 （2-1、 2-2） （100 T／50 樣， 批 號(hào)20170419）、 考馬斯亮蘭 （100 T／96 樣， 批號(hào)20170421，南京建成生物工程研究所）； 大鼠腎上腺素（EPI， 批號(hào)CSB-E08678r）、 大 鼠 前 列 腺 素E2（PGE2， 批 號(hào) CSBE07967r） ELISA 試劑盒（96T， 武漢華美生物工程有限公司）。 電子天平（型號(hào)YB502N， 上海海康電子儀器廠）；掃描電子顯微鏡（型號(hào)S-570， 日本日立公司）； 紫外可見分光光度計(jì)（型號(hào)UV8000S， 上海元析儀器有限公司） ；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號(hào)RE52CS， 上海亞榮生化儀器廠）； 循環(huán)水式真空泵（型號(hào)SHZ-DⅢ， 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）； 代謝籠。

2 方法

2.1 分組及給藥 將56 只大鼠隨機(jī)分為7 組， 每組8 只，分別為空白組、 干姜煮汁制附子組、 生姜煮汁制附子組、生姜榨汁制附子組、 干姜片拌蒸制附子組、 生姜片拌蒸制附子組、 生附子組， 各組給藥劑量均為1.54 g 生藥／kg（按2015 版《中國(guó)藥典》 成人臨床最大用藥量60 kg 體質(zhì)量換算）， 每天灌胃給藥1 次， 灌胃量為15 mL／kg 體質(zhì)量，連續(xù)31 d， 其間不間斷提供飼料和水。

2.2 熱性證狀指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 舌像 各組大鼠在實(shí)驗(yàn)第31 天給藥1 h 后處死， 鑷子頂開大鼠上下頜暴露出舌體， 輕拉出舌體， 同時(shí)于舌體根部用手術(shù)剪剪斷， 迅速用生理鹽水清洗舌體， 將舌體固定于2.5%戊二醛溶液中備用。 從固定液中取出大鼠舌體，0.1 mol／L 磷酸鹽緩沖液漂洗干凈后， 1% 鋨酸固定至少2 h， 50%、 70%、 90%、 95% 乙醇逐步進(jìn)行脫水處理， 再換成醋酸異戊酯， 每次浸泡約15 min， 干燥舌體后， 掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)。

2.2.2 宏觀體征 各組大鼠預(yù)置于代謝籠內(nèi)飼養(yǎng)3 d 以適應(yīng)環(huán)境， 首次灌胃給藥前稱定體質(zhì)量， 肛溫計(jì)測(cè)量肛溫，從給藥當(dāng)天起每5 d 記錄1 次肛溫、 飲食量、 飲水量， 再稱定體質(zhì)量， 共觀察31 d。

2.2.3 肝組織Na＋-K＋-ATP 酶活性 末次給藥1 h 后， 大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉， 劑量0.3 mL／kg 體質(zhì)量，開腹分離肝臟周遭韌帶， 迅速剪取活體肝組織， 立即用磷酸緩沖鹽溶液清洗， 錫箔紙包裹后置于液氮中保存， 再轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中。 精密稱取肝組織1 g， 冰浴下加入9 mL生理鹽水勻漿， 均勻勻漿后3 000 r／min 離心約10 min， 取上清液， 加入9 倍量生理鹽水制成1%肝組織勻漿液， 按照考馬斯亮藍(lán)試劑盒及超微量Na＋-K＋-ATP 酶測(cè)試盒說明書進(jìn)行操作。

2.2.4 血清EPI、 PGE2水平 末次給藥1 h 后， 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉， 劑量0.3 mL／kg 體質(zhì)量， 備皮，開腹， 腹 主 動(dòng) 脈 取 血， 凝 固 （4 ℃） 60 min 后 離 心（3 000 r／min） 5 min 得到血清， 置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?按照EPI、 PGE2血清試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理， 計(jì)量資料以（±s）表示， 不滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求的數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，組間比較采用單因素方差分析。 以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 舌像

3.1.1 姜制對(duì)大鼠舌體絲狀乳頭數(shù)目的影響 與空白組比較， 各姜制附子組大鼠舌體絲狀乳頭數(shù)目均有不同程度的增加， 以生姜煮汁制附子組更顯著（P＜0.05）。 見表1。

表1 姜制對(duì)大鼠舌體絲狀乳頭數(shù)目的影響（±s， n＝8）

表1 姜制對(duì)大鼠舌體絲狀乳頭數(shù)目的影響（±s， n＝8）

注：與空白組比較，?P＜0.05

組別 絲狀乳頭數(shù)目空白組 60.63±10.68生附子組 66.25±10.26生姜榨汁制附子組 67.38±22.51生姜煮汁制附子組 80.13±20.83?生姜片制附子組 79.00±26.54干姜煮汁制附子組 67.88±18.47干姜片制附子組 61.25±12.46

3.1.2 姜制對(duì)大鼠舌體絲狀乳頭角質(zhì)化程度的影響 與空白組比較， 生附子組大鼠舌體絲狀乳頭基部更粗糙， 但角質(zhì)變厚， 剝落現(xiàn)象不明顯； 生姜制附子組大鼠舌體絲狀乳頭基部角質(zhì)化程度明顯， 角質(zhì)層厚， 裂紋及脫落嚴(yán)重； 干姜制附子組大鼠絲狀乳頭表面凹凸不平， 角質(zhì)層厚且粗糙，脫落現(xiàn)象不明顯。 見圖1。

3.1.3 姜制對(duì)大鼠舌體蕈狀乳頭角質(zhì)化程度的影響 與空白組比較， 生附子組大鼠蕈狀乳頭角質(zhì)層更厚； 與空白組、生附子組比較， 各姜制附子組大鼠蕈狀乳頭周遭有大量角質(zhì)層包裹， 而且角質(zhì)層厚， 裂紋多， 有剝落痕跡。 見圖2。

3.2 宏觀體征

3.2.1 體質(zhì)量 各組大鼠體質(zhì)量均無明顯變化。

3.2.2 肛溫 除空白組、 生姜片制附子組外， 各組大鼠肛溫在給藥后出現(xiàn)下降趨勢(shì)， 在第6 ～11 天開始回升或上升變快， 在第16 天左右開始下降， 在第21 天后又開始上升，從第26 天起與空白組相比， 除生附子組、 生姜榨汁制附子組外均有顯著差異（P＜0.05）。 見圖3。

3.2.3 飲食量 各組大鼠飲食量隨飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)均有略微增多趨勢(shì)， 但無明顯變化。

3.2.4 飲水量 各組大鼠飲水量隨飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加， 從第26 天起開始超過空白組， 并隨時(shí)間推移出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。 見圖4。

3.3 肝組織Na＋-K＋-ATP 酶活性 與空白組比較， 生附子組、 干姜煮汁制附子組大鼠Na＋-K＋-ATP 酶活性顯著降低（P＜0.01）； 與生附子組比較， 各姜制附子組其活性均顯著升高（P＜0.01）。 見表2。

圖1 姜制對(duì)大鼠舌體絲狀乳頭角質(zhì)化程度的影響（×1 000）

圖2 姜制對(duì)大鼠舌體蕈狀乳頭角質(zhì)化程度的影響（×1 000）

圖3 各組大鼠肛溫變化

表2 姜制對(duì)大鼠肝組織Na＋-K＋-ATP 酶活性的影響（±s，n＝8）

表2 姜制對(duì)大鼠肝組織Na＋-K＋-ATP 酶活性的影響（±s，n＝8）

組別 Na＋-K＋-ATP 酶活性／（U·mg prot-1）空白組 4.67±0.51＃＃生附子組 2.72±0.29??生姜榨汁制附子組 4.12±0.68＃＃生姜煮汁制附子組 4.30±0.59＃＃生姜片制附子組 4.60±0.36＃＃干姜煮汁制附子組 4.09±0.61＃＃??干姜片制附子組 4.76±0.72＃＃

圖4 各組大鼠飲水量變化

注：與空白組比較，??P＜0.01；與生附子組比較，＃＃P＜0.01 3.4 血清EPI、 PGE2水平 由于血清EPI、 PGE2水平指標(biāo)個(gè)體差異較大， 為了避免數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)無意義， 在數(shù)據(jù)處理時(shí)對(duì)其進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換以符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。 與空白組比較， 除干姜片制附子組兩者水平顯著降低（P＜0.05） 外， 各組均有升高趨勢(shì)， 以生姜榨汁制附子組更顯著（P＜0.05）。 見表3。

4 討論

動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)［7］， 大鼠與人類相似， 具備中醫(yī)診斷和證候的變化， 并且模型易于推廣［8］。 中醫(yī)看病注重舌苔變化， 舌與臟腑有著密切聯(lián)系， 可通過舌像來了解機(jī)體狀態(tài)本質(zhì)， 其中體質(zhì)量、 肛溫、 飲食量、 飲水量能最客觀直接地反映出機(jī)體的形體及生理狀態(tài)， 能較好地符合中醫(yī)對(duì)人體問診的過程， 故選擇上述指標(biāo)作為外在表征。 Na＋-K＋-ATP 酶存在于細(xì)胞膜上， 維持著細(xì)胞靜息電位， 與細(xì)胞攝入能量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、 排出代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，可反映細(xì)胞活動(dòng)狀態(tài)［9］； 腎上腺素是一種能使人新陳代謝大大加速的激素和神經(jīng)傳遞物質(zhì)， 可增加小血管阻力， 強(qiáng)化心肌收縮和耗氧， 增加機(jī)體中央血流量［10］； 前列腺素E2可雙向調(diào)節(jié)血壓［11］， 并對(duì)人體免疫系統(tǒng)有著復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用［6］， 同時(shí)在人體致熱過程中發(fā)揮重要作用， 故選擇上述指標(biāo)作為內(nèi)在表征。

表3 姜制對(duì)大鼠血清EPI、 PGE2 水平的影響（±s， n＝8）

表3 姜制對(duì)大鼠血清EPI、 PGE2 水平的影響（±s， n＝8）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與生附子組比較，＃P＜0.05

組別 EPI PGE2空白組 1.01±0.25 0.89±0.19生附子組 1.38±0.47 1.27±0.44生姜榨汁制附子組 1.43±0.58? 1.35±0.58?生姜煮汁制附子組 1.11±0.49 1.00±0.47生姜片制附子組 1.10±0.35 1.02±0.37干姜煮汁制附子組 1.20±0.35 1.14±0.39干姜片制附子組 0.87±0.26＃ 0.77±0.32＃

中醫(yī)熱癥有舌體發(fā)紅、 舌苔厚且黃、 口渴、 體溫不穩(wěn)等癥狀［12］， 舌診是中醫(yī)觀察疾病的基本手段之一［13］， 《皇帝內(nèi)經(jīng)》 中即有記載與理論， 現(xiàn)有研究也認(rèn)為舌有豐富的血管與神經(jīng)分布， 對(duì)機(jī)體健康狀態(tài)有著靈敏直接的反應(yīng)［14］。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 各姜制附子組大鼠舌乳頭均有數(shù)目增多、 角質(zhì)層明顯增厚的現(xiàn)象， 導(dǎo)致舌苔發(fā)黃發(fā)厚， 呈現(xiàn)熱證舌像， 表明生附子及姜制附子均有令機(jī)體產(chǎn)生熱性證狀的趨勢(shì)， 同時(shí)各組大鼠肛溫變化不定， 飲水量在給藥后期也與空白組出現(xiàn)顯著差異， 這些體征指標(biāo)也均符合中醫(yī)臨床熱癥的體征表現(xiàn)， 均對(duì)機(jī)體有肯定的致熱作用。 另外，大鼠體質(zhì)量、 飲食量無明顯變化， 可能原因是給藥量不高，在臨床人使用劑量范圍內(nèi)換算對(duì)大鼠的熱性影響比較緩和，具體有待進(jìn)一步研究。

同時(shí)， 生附子組大鼠Na＋-K＋-ATP 酶活性與其他各姜制附子組比較顯著偏低， 導(dǎo)致細(xì)胞能量生成和消耗出現(xiàn)障礙， 使得心肌細(xì)胞紊亂， 引起心臟疾病發(fā)生［9］， 可能也是附子毒性發(fā)揮的機(jī)制之一； 各種姜制附子組大鼠Na＋-K＋-ATP 酶活性與生附子組比較均有顯著提高， 表明姜制可緩解其毒性。

腎上腺素（EPI） 可增加機(jī)體對(duì)能量的消耗， 而前列腺素E2（PGE2） 在機(jī)體致熱過程中發(fā)揮重要作用［6］。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 除干姜片制附子組兩者水平與空白組比較顯著降低外， 各組均有不同程度的升高趨勢(shì)， 以生姜榨汁制附子組更顯著， 表明姜制附子可在一定程度上提高大鼠機(jī)體產(chǎn)熱和能量代謝水平， 尤其是生姜榨汁制附子， 其原因可能是未經(jīng)加熱處理過的姜汁中某些成分可與附子成分發(fā)揮協(xié)同作用， 具體還有待進(jìn)一步研究。

通過考察大鼠體內(nèi)、 外熱性證狀指標(biāo)顯示， 各姜制附子組中生姜榨汁制附子對(duì)機(jī)體熱性影響最為突出。 生姜榨汁是唯一在附子蒸煮加工前使用未經(jīng)加熱處理的姜產(chǎn)品長(zhǎng)時(shí)間潤(rùn)制藥材的輔料， 由于姜在加熱后所含揮發(fā)油、 姜辣素、 游離氨基酸微量元素等成分的含有量均降低［15］， 而且中醫(yī)理論認(rèn)為干姜汁主制藥物寒性， 鮮姜汁緩和藥物毒副作用， 同時(shí)生姜解表， 干姜溫里［16］， 故附子炮制后的藥性變化可能與鮮姜汁中含有量較高的成分有更大關(guān)聯(lián)。

綜上所述， 本實(shí)驗(yàn)通過熱性的機(jī)體內(nèi)、 外表征指標(biāo)，考察了基于樟幫、 建昌幫炮制的不同姜輔料所制備附子飲片對(duì)大鼠機(jī)體的影響， 發(fā)現(xiàn)各種姜輔料均可對(duì)附子產(chǎn)生一定解毒作用， 并在一定程度上加強(qiáng)附子熱性， 以生姜榨汁制附子最顯著。 今后， 將開展不同姜輔料和姜制附子成分分析及動(dòng)物代謝組學(xué)、 物質(zhì)能量代謝等方面的考察， 以期對(duì)其藥性和藥效進(jìn)行探討。