甘草微型飲片切制工藝及UPLC 指紋圖譜

任曉航， 岳英男， 魏曉峰， 李祥溦， 劉博男， 史 輯，，?

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 大連116600； 2. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局炮制原理解析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧大連116600； 3. 遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心， 遼寧 大連116600）

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch、 脹果甘草Glycyrrhiza inflate Bat 或光果甘草Glycyrrhiza glabra L. 的干燥根及根莖［1］， 其味甘、性平， 具有補(bǔ)脾益肺、 清熱解毒、 祛痰止咳、 緩急止痛、 調(diào)和諸藥等功效， 在多個(gè)傳統(tǒng)經(jīng)典方劑中起著調(diào)和諸藥、 緩和藥性等作用。 現(xiàn)代藥理研究表明， 甘草具有抗?jié)儭?解痙、 抗菌、 抗炎、 調(diào)血脂、 鎮(zhèn)痛、 雌性激素樣等作用［2-3］， 其主要化學(xué)成分包括三萜、 黃酮、 香豆素、 多糖等［4-5］， 在我國(guó)主要分布于內(nèi)蒙古、 新疆、 甘肅、 黑龍江等地［6-7］。

中藥飲片是中藥材經(jīng)過炮制后能直接用于中醫(yī)臨床和中成藥生產(chǎn)的處方藥， 是國(guó)家基本藥物； 中藥炮制是按照中醫(yī)藥理論對(duì)中藥材進(jìn)行各種加工處理的技術(shù)， 也是一項(xiàng)傳統(tǒng)的制藥技術(shù)， 最早的飲片稱為“口父咀”。 中藥飲片是中醫(yī)臨床辨證施治、 復(fù)方配伍的基本物質(zhì)， 也是中醫(yī)臨床靈活用藥的獨(dú)特產(chǎn)品， 能適應(yīng)中醫(yī)臨床一病一方的特點(diǎn)， 但隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏加快， 采用傳統(tǒng)秤稱手抓的調(diào)劑方式速度慢， 精準(zhǔn)度不夠， 煎出率低， 勞動(dòng)強(qiáng)度大， 影響了臨床應(yīng)用。 賈天柱教授首次提出“微型飲片”概念［8］， 其直徑在0.5～1.0 cm 左右， 具有流動(dòng)性好、 煎出率高的特點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)將甘草傳統(tǒng)飲片形式進(jìn)一步加工成微型飲片， 以其流動(dòng)性、 干膏率、 主要化學(xué)成分含有量為評(píng)價(jià)指標(biāo)， 通過正交試驗(yàn)對(duì)其切制工藝進(jìn)行優(yōu)化。 同時(shí)， 建立甘草微型飲片UPLC 指紋圖譜［9］，并應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件對(duì)10 批微型飲片進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 ACQUITY H-class 色譜儀 （美國(guó)Waters 公司）； 細(xì)集料流動(dòng)時(shí)間測(cè)定儀（紹興市上虞越達(dá)儀器廠）； FA1004 型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）； AE240 型電子分析天平（十萬分之一， 瑞士梅特勒-托利多公司）； KQ-250E 型醫(yī)用超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）； 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）。

1.2 材料 甘草酸對(duì)照品（批號(hào)D0708AS， 含有量＞98%）、 甘草苷對(duì)照品（批號(hào)J1016AS， 含有量＞98%）、 甘草次酸對(duì)照品（批號(hào)N1110AS， 含有量＞98%）、 甘草查爾酮對(duì)照品（批號(hào)S0716AS，含有量＞98%）、 甘草素對(duì)照品（批號(hào)N0324AS，含有量＞98%）、 異甘草素對(duì)照品（批號(hào)J1009AS，含有量＞98%） 均由大連美侖生物技術(shù)有限公司提供。 甲醇、 乙腈、 磷酸均為色譜純； 其他試劑均為分析純； 水為超純水。

收集了10 批不同來源的甘草， 經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院翟延君教授鑒定為正品， 具體見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 含有量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取甘草酸、 甘草苷、 甘草素、 甘草查爾酮、 異甘草素、 甘草次酸對(duì)照品適量， 置10 mL 量瓶中， 甲醇定容， 即得。 其中， 各對(duì) 照 品 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為0.574、 0.68、0.278、 0.383、 0.238、 0.433 mg／mL。

2.1.2 飲片切制 取甘草（統(tǒng)貨） 適量， 采用泡潤(rùn)法進(jìn)行軟化， 切制成斜片， 50 ℃下干燥。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取樣品5 g， 置250 mL 具塞錐形瓶中， 精密加入70%乙醇100 mL，密塞， 稱定質(zhì)量， 超聲（250 W、 40 kHz） 30 min，放冷， 70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 過濾， 取續(xù)濾液， 即得。

2.1.4 色譜條件 BEH C18色譜柱 （2.1 mm×50 mm， 1.7 μm）； 流動(dòng)相乙腈-0.1% 磷酸， 梯度洗脫（0 min， 10%A； 0 ～4.5 min， 32%A； 4.5 ～10 min， 70%A； 10 ～16 min， 95%A； 16 ～18 min，10%A）； 體積流量0.3 mL／min； 柱溫25 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm； 進(jìn)樣量1 μL。 色譜圖見圖1。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液， 在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣， 以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）， 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 結(jié)果見表2， 可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液，在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次， 每次1 μL， 測(cè)得6 種成分峰面積RSD 分別為0.56%、0.78%、 0.69%、 1.59%、 1.57%、 1.59%， 表 明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下于0、 2、 4、 6、 8、 10、12、 24 h 進(jìn)樣， 測(cè)得6 種成分峰面積RSD 分別為1.05%、 1.46%、 1.77%、 1.91%、 1.07%、0.58%， 表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品6 份， 按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣， 測(cè)得6 種成分峰面積RSD 分別為1.48%、 1.29%、 1.59%、 1.23%、 0.98%、1.20%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 稱取含有量已知的微型飲片6 份， 精密稱定， 每份約1.0 g， 精密加入等量對(duì)照品溶液， 在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果， 各成分平均加樣回收率分別為101.8%（RSD ＝1.5%）、 100.2%（RSD ＝0.89%）、 101.3%（RSD ＝0.68%）、 98.6% （RSD ＝1.9%）、 102.5%（RSD＝1.1%）、 99.4（RSD＝0.29%）。

2.1.10 樣品含有量測(cè)定 供試品溶液在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下計(jì)算6 種成分綜合含有量，公式為綜合含有量＝0.3 （A／Amax＋B／Bmax） ＋0.1（C／Cmax＋D／Dmax＋E／Emax＋F／Fmax） （A、 B、 C、 D、E、 F 分別為甘草酸、 甘草苷、 甘草素、 異甘草素、甘草查耳酮、 甘草次酸）。

2.2 干膏率測(cè)定 精密稱取樣品10 g， 置于250 mL圓底燒瓶中， 15 倍量水回流提取3 次， 每次1.5 h， 濃縮， 合并， 置干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中， 水浴蒸干， 105 ℃下干燥5 h， 于干燥器內(nèi)放冷后， 迅速精密稱定， 得樣品干膏率。

2.3 飲片流動(dòng)性測(cè)定 取微型飲片10 g， 放入細(xì)集料流動(dòng)時(shí)間測(cè)定儀中測(cè)定流動(dòng)時(shí)間， 重復(fù)10 次，取平均值。

2.4 切制工藝優(yōu)化

2.4.1 試驗(yàn)方法 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)， 選取飲片粒徑（A）、 厚度（B）、 軟化時(shí)間（C）、 干燥溫度（D）4 個(gè)因素， 每個(gè)因素3 個(gè)水平， 采用L9（34）正交表安排試驗(yàn)， 因素水平見表3。 再計(jì)算綜合評(píng)分， 公式為綜合評(píng)分＝0.4X／Xmax＋0.4Y／Ymax＋0.2Z／Zmax（X 為有效成分綜合含有量， Y 為干膏率， Z 為流動(dòng)時(shí)間）， 結(jié)果見表4～5。

表3 因素水平Tab.3 Fators and levels

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.4 Design and results of tests

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

2.4.2 結(jié)果分析 由表5 可知， 在切制工藝中飲片厚度具有顯著影響（P＜0.05）。 確定最佳工藝為A1B1C1D1， 即飲片粒徑0.5 ～0.9 mm， 厚度1 mm，軟化時(shí)間1 h， 干燥溫度50 ℃。

2.5 UPLC 指紋圖譜建立

2.5.1 色譜條件 同“2.1.4” 項(xiàng)。

2.5.2 供試品溶液制備 同“2.1.3” 項(xiàng)。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液， 在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)測(cè)定6 次， 測(cè)得各主要色譜峰的保留時(shí)間和峰面積RSD 均小于3%， 表明該方法精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，于0、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 24 h 在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定， 測(cè)得各主要色譜峰的保留時(shí)間和峰面積RSD 均小于3%， 表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批飲片6 份， 按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1.4”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定， 測(cè)得各主要色譜峰的保留時(shí)間和峰面積RSD 均小于3%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 相似度測(cè)定 取10 批供試品溶液， 在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定， 將所得指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A），對(duì)色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正并自動(dòng)匹配， 生成UPLC 指紋圖譜， 見圖2， 計(jì)算相似度， 見表6， 有25 個(gè)共有指紋色譜峰， 由于每個(gè)樣品的非共有峰峰面積均小于總面積的10%， 因此符合指紋圖譜要求。 另外， 10 批微型飲片與對(duì)照指紋圖譜的相似度均＞0.9， 具有較好的一致性， 表明切制方法及規(guī)格可行， 質(zhì)量可控。

圖2 10 批樣品UPLC 指紋圖譜Fig.2 UPLC fingerprints of ten batches of samples

3 討論

3.1 樣品來源 對(duì)收集得到的甘草進(jìn)行含有量測(cè)定， 發(fā)現(xiàn)甘草苷、 甘草酸均符合2015 年版《中國(guó)藥典》 相關(guān)規(guī)定（分別不得少于0.50%、 2.0%）。

表6 10 批樣品相似度Tab.6 Similarities of ten batches of samples

3.2 樣品前處理 切制是中藥材炮制為飲片的關(guān)鍵環(huán)節(jié)， 《五十二病方》 中載有“細(xì)切” “削”“剡” 等， 都指的是切制， 目的是便于飲片有效成分的煎出， 有利于進(jìn)一步炮制和制劑。 甘草纖維性強(qiáng)， 組織致密， 切制成粒徑較小的微型飲片亦不易破碎， 且軟化及干燥過程中有效成分不易流失。

采用單因素試驗(yàn)考察甘草不同飲片類型中有效成分的含有量， 發(fā)現(xiàn)微型飲片明顯高于甘草斜片及圓片（圓片內(nèi)徑約2 cm； 斜片長(zhǎng)軸約5 cm， 短軸約2 cm）， 而甘草粉末雖然溶出率稍高， 但在煎煮過程中會(huì)出現(xiàn)糊鍋現(xiàn)象， 且不易過濾， 雜質(zhì)過多［10-12］， 因此將正交設(shè)計(jì)中的直徑控制在0.5 ～2.0 cm 之間。 同時(shí)， 對(duì)飲片切制前的軟化方法進(jìn)行了單因素試驗(yàn)考察， 發(fā)現(xiàn)泡潤(rùn)法軟化在工藝操作和有效成分含有量方面都優(yōu)于淋潤(rùn)法、 蒸制法軟化。 根據(jù)潤(rùn)制過程中是否能保證片形完整性， 本實(shí)驗(yàn)以軟化1、 2、 3 h 作為控制水平。

3.3 色譜條件選擇 甘草成分比較復(fù)雜， 主要有三萜皂苷（甘草酸、 甘草次酸）、 黃酮（甘草苷、異甘草苷）、 甘草多糖等。 2015 版《中國(guó)藥典》 中甘草的質(zhì)量控制只以甘草酸、 甘草苷作為含有量測(cè)定指標(biāo)， 不能系統(tǒng)完整地反映藥材內(nèi)在質(zhì)量。 本實(shí)驗(yàn)采用UPLC 法同時(shí)測(cè)定甘草中6 種成分的含有量來評(píng)價(jià)工藝參數(shù)， 參考HPLC 條件， 采用C18反相色譜柱， 0.1%磷酸-乙腈梯度洗脫［13-15］， 同時(shí)考察了0.3、 0.6 mL／min 體積流量， 發(fā)現(xiàn)0.3 mL／min下各色譜峰出峰時(shí)間較好， 同時(shí)10% ～95%乙腈梯度洗脫也保證了色譜峰分離效果適中。

3.4 指紋圖譜建立 本實(shí)驗(yàn)所建立的甘草微型飲片UPLC 指紋圖譜［16-17］中確定了25 個(gè)共有峰， 對(duì)其進(jìn)行歸屬分析后指認(rèn)了甘草苷、 甘草酸、 甘草素、 甘草次酸、 異甘草素、 查耳酮。 同時(shí)， 它與傳統(tǒng)飲片指紋圖譜對(duì)比沒有明顯差異。

3.5 飲片流動(dòng)性 流速是測(cè)定粉體流動(dòng)性的指標(biāo)之一， 一般來說微粉流速快， 表明其流動(dòng)均勻性理想， 即流動(dòng)性好［18］； 流動(dòng)時(shí)間越短， 摩擦力越小，流動(dòng)性越好。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 甘草微型飲片的流動(dòng)性明顯優(yōu)于斜片及圓片， 更適合智能配方機(jī)的使用， 可大大提高工作人員抓藥效率， 同時(shí)能改善工作環(huán)境。

3.6 應(yīng)用前景 中藥飲片作為中醫(yī)臨床應(yīng)用的物質(zhì)基礎(chǔ)， 其質(zhì)量?jī)?yōu)劣直接影響臨床療效。 微型飲片在一定程度上解決了傳統(tǒng)飲片在倉(cāng)儲(chǔ)、 調(diào)劑、 服用等方面的問題， 使臨床處方中的藥物比例更加準(zhǔn)確穩(wěn)定。 它既保留了傳統(tǒng)飲片隨癥加減的特色， 又增加了其實(shí)用性， 使臨床用藥更加方便快捷， 從而保障最強(qiáng)藥效。?