2 種炮制方法對何首烏中6 種成分變化的影響

楊 磊， 劉夢嬌， 陳文明， 戴 冰， 張志國， 張 琴?

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 湖南 長沙410007； 2. 全國名老中醫(yī)藥專家張志國傳承工作室， 湖南長沙410007； 3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 湖南 長沙410208）

何首烏為蓼科植物何首烏 Polygonum multiflorum Thunb. 的塊根， 生品解毒消癰、 截瘧、潤腸通便， 炮制品補(bǔ)肝腎、 益精血、 烏須發(fā)［1］，臨床多以制何首烏入藥， 最早見于唐朝《何首烏傳》， 歷朝歷代均有記載。 縱觀古籍文獻(xiàn)， 何首烏炮制方法大致分為凈制、 切制、 不加輔料制、 加輔料制、 藥汁制幾大類， 約20 余種［2］， 經(jīng)歷了由簡到繁的炮制過程， 其中“九蒸九曬” 法大致形成于宋朝， 并沿用到近代， 是其經(jīng)典炮制方法， 由于古法炮制的繁瑣、 耗時、 耗能， 不能滿足中藥現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)的要求， 故逐漸簡化成《中國藥典》記載的“燉至液汁吸盡” 或“蒸至內(nèi)外均呈棕褐色” 時曬干切片［1］。 目前， 有大量學(xué)者對藥典所載炮制方法的工藝、 化學(xué)成分、 藥理藥效等展開研究［3-7］， 但鮮有將“九蒸九曬” 法與藥典方法進(jìn)行對比研究。 本實驗擬將2 種炮制方法對何首烏中6種成分含有量的變化進(jìn)行研究， 為進(jìn)一步闡明兩者對該藥材療效和毒性的影響提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent Techologies 1260 InfinityⅡ型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）； JJW-3KVA 型精密凈化交流穩(wěn)定電源、 SK-5200H 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）； XMTB-8000 型干燥箱（余姚市金宏儀器廠）； AR2140 型電子分析天平（上海海鴻精密儀器有限公司）。

1.2 試藥 二苯乙烯苷對照品 （批號110844-201512）、 大黃素對照品（批號0756-200110）、 大黃素甲醚對照品（批號758-9301）、 大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品（批號Z25A7B13739）、 沒食子酸對照品（批號0831-9501）、 5-羥甲基糠醛對照品（批號A22J7L16607） 均由中國食品藥品檢定研究院提供。 乙腈（色譜純）、 甲醇（分析純）、 磷酸（色譜純） 購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司； 水為超純水。

何首烏購于湖南南國藥都中藥飲片有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制教研室張志國教授鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb. 的干燥塊根； 黑豆為市售。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 “九蒸九曬” 炮制品 根據(jù)前期實驗確定的條件， 取黑豆60 g， 加6 000 mL 水煮4 h， 熬汁900 mL， 豆 渣 再 加 水4 800 mL 煮3 h， 熬 汁600 mL， 合并黑豆汁共1 500 mL。 取何首烏飲片600 g， 用黑豆汁拌勻， 常壓隔水蒸4 h， 曬干， 復(fù)蒸4 h， 曬干， 如此反復(fù)9 次。 每曬干1 次， 取50 g留樣。

2.1.2 藥典法炮制品 取何首烏飲片600 g， 照蒸制法（ 《中國藥典》 通則0213） 加入黑豆汁拌勻后， 放入蒸柜蒸22 h， 經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院張志國教授等多位專家評定， 飲片內(nèi)外均呈棕褐色， 符合藥典描述， 再置于烘箱內(nèi)80 ℃下烘干，即得。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相乙腈（A）-0.01%磷酸（B），梯度洗脫， 程序見表1； 體積流量1.0 mL／min； 檢測波長295 nm； 柱溫30 ℃。 色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 對照品溶液 精密稱取二苯乙烯苷、 大黃素、 大黃素甲醚、 大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、沒食子酸、 5-羥甲基糠醛對照品適量， 甲醇溶解至刻度， 得質(zhì)量濃度分別為0.35、 0.1、 0.05、 0.026、0.1、 0.042 mg／mL 的對照品溶液。

2.2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品0.5 g， 精密加入甲醇25 mL， 稱定質(zhì)量， 超聲提取30 min， 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 取續(xù)濾液， 過0.45 μm 微孔濾膜， 即得。

2.2.3 線性關(guān)系考察 分別吸取“2.2.2.1” 項下混合對照品溶液1、 2、 4、 6、 8、 10 μL， 在“2.2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣， 以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）， 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 結(jié)果見表2， 表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.2.4 精密度試驗 取“2.2.2.1” 項下對照品溶液， 在“2.2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣6 次， 測得二苯乙烯苷、 大黃素、 大黃素甲醚、 大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、 沒食子酸、 5-羥甲基糠醛峰面積RSD 分 別 為 0.65%、 1.35%、 0.82%、 2.01%、1.64%、 0.78%， 表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2.2” 項下供試品溶液， 于室溫下0、 2、 4、 8、 10、 12、 24 h 在“2.2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣， 測得二苯乙烯苷、大黃素、 大黃素甲醚、 大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、 沒食子酸、 5-羥甲基糠醛峰面積RSD 分別為1.16%、 0.98%、 1.52%、 0.59%、 0.68%、 1.35%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一樣品6 份， 按“2.2.2.2” 項 下 方 法 制 備 供 試 品 溶 液， 在“2.2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣， 測得二苯乙烯苷、大黃素、 大黃素甲醚、 大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、 沒食子酸、 5-羥甲基糠醛峰面積RSD 分別為0.75%、 0.88%、 1.26%、 1.48%、 0.81%、 1.89%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的樣品6 份， 精密加入二苯乙烯苷、 大黃素、 大黃素甲醚、 大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、 沒食子酸、 5-羥甲基糠醛對照品， 按“2.2.2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣， 計算回收率， 結(jié)果見表3。

2.3 樣品含有量測定 將供試品溶液在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣， 計算含有量， 結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 炮制工藝參數(shù)選擇 “九蒸九曬” 是何首烏古代傳統(tǒng)的炮制方法， 宋代《本草圖經(jīng)》［8］首次記載“采時乘濕以布帛拭去土， 后用苦竹刀切， 米泔浸一宿， 曝干， 九蒸九曝， 乃可服”， 后世經(jīng)過不斷的發(fā)展一直沿用至近代。 中醫(yī)理論認(rèn)為， 黑色入腎經(jīng)， 何首烏炮制輔料為黑豆， 蒸制時間要求多以“豆熟” “豆?fàn)€” 為度； 課題組前期實驗證明，黑豆蒸制約2 h 即可達(dá)到“豆熟” 狀態(tài)， 蒸制6 h即達(dá)到“豆?fàn)€” 程度； 本實驗取中間值， 將何首烏拌黑豆汁蒸4 h， 曬干， 如此反復(fù)9 次。 對依據(jù)藥典炮制方法生產(chǎn)的制首烏， 按實際生產(chǎn)情況結(jié)合藥典中的成品性狀描述， 確定連續(xù)蒸制22 h。

3.2 色譜條件選擇 本實驗考察了不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇分別采用超聲、 加熱回流進(jìn)行提取， 結(jié)果表明以純甲醇超聲提取15 min 時， 6 種成分含有量較高。 同時， 考察了Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、 YWG-C18（250 mm×4.6 mm， 10 μm） 色譜柱的分離效果， 結(jié)果表明前者在分離效果和柱壓方面都優(yōu)于后者， 故選用Agilent C18色譜柱。 再考察了乙腈-水、 乙腈-0.01% 磷酸、 乙腈-0.05% 磷酸、 甲醇-水等流動相， 最終采用乙腈-0.01% 磷酸， 此時各成分的分離度良好， 峰形較佳。 另外，檢測波長295 nm 時的色譜峰分離度優(yōu)于270、280 nm， 柱溫30 ℃時的優(yōu)于25、 35 ℃。

3.3 不同炮制方法比較 何首烏炮制后二苯乙烯苷、 結(jié)合型蒽醌（大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷）含有量降低， 游離蒽醌（大黃素、 大黃素甲醚）、沒食子酸含有量升高， 5-羥甲基糠醛為炮制后新產(chǎn)生成分， 在生品和一蒸、 二蒸品中未檢出， 從三蒸三曬開始出現(xiàn)， 并隨蒸曬次數(shù)的增加而增加， 除沒食子酸外其余成分的含有量均與蒸曬次數(shù)及炮制時間呈正相關(guān)性； 依據(jù)藥典制備的炮制品中各化學(xué)成分含有量相當(dāng)于五蒸五曬品， 兩者在炮制時間上也大致相同。 “九蒸九曬” 法中二苯乙烯苷含有量相當(dāng)于藥典法的49.8%， 游離蒽醌大黃素、 大黃素甲醚含有量比藥典法高約30%， 結(jié)合型蒽醌大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷幾乎檢測不到， 沒食子酸含有量與藥典法相比差異不大。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents （n＝6）

表4 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g， n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg／g， n＝3）

何首烏肝毒性可能與二苯乙烯苷與蒽醌類、 鞣質(zhì)類成分相關(guān)［9］， 大劑量、 長期服用該成分可造成可逆性肝細(xì)胞損傷［10］。 結(jié)合蒽醌是游離蒽醌與苷以結(jié)合的形式存在， 在炮制過程中加熱水解生成游離蒽醌和糖， 其瀉下作用和肝毒性均大于游離蒽醌［11］， 因此化學(xué)成分不同是否與何首烏功效改變、毒性差異有相關(guān)性值得深入研究。 本實驗可為為何首烏炮制工藝、 安全性評價與臨床療效的關(guān)系提供理論依據(jù)， 也能進(jìn)一步保證該藥材的臨床安全用藥。