槜李葉片DNA提取方法探討

李白，李軍，王蕾，種高軍*

(1.嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 嘉興 314016； 2.嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與環(huán)境分院，浙江 嘉興 314036)

槜李是薔薇科(Rosaceae)李屬(PrunusL.)植物中栽培中國李(PrunussalicinaLindl.)的一個(gè)品種群，原產(chǎn)于浙江省嘉興市，桐鄉(xiāng)槜李于2011年獲農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志保護(hù)登記[1]。槜李果實(shí)熟透后果肉化成漿液，有酒香味，品質(zhì)上乘，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高[2]。提取高質(zhì)量的植物基因組 DNA 是有效開展分子育種、品種鑒定、基因功能研究等分子生物學(xué)研究的前提[3-4]。槜李為多年生木本植物，體內(nèi)富含酚類、色素、多糖等物質(zhì)，這給其DNA提取帶來困難，其中多糖污染是DNA提取中最常遇到的問題[4-7]。多糖污染的DNA較黏稠，呈膠狀，不利實(shí)驗(yàn)操作，且多糖對(duì)后續(xù)分子生物學(xué)反應(yīng)體系中的酶活性可能產(chǎn)生抑制作用，影響下游研究[5,7-8]。常規(guī)的 DNA 提取方法不能有效除去多糖，提取木本果樹DNA質(zhì)量較差[4,9]。經(jīng)典的CsCl梯度離心能有效除去木本果樹的多糖，獲得的DNA純度高，但CsCl梯度離心設(shè)備費(fèi)用高昂，操作不便，且DNA得率低，應(yīng)用范圍有限。隨著分子標(biāo)記等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)量快速增長(zhǎng)，DNA提取方法應(yīng)考慮對(duì)實(shí)驗(yàn)人員與環(huán)境的安全，并適用于批量提取大量樣品，且盡量避免使用有害試劑[10-11]。本研究報(bào)道了一種適用于槜李葉片高質(zhì)量基因組DNA提取的方法，為槜李等富含多糖的木本果樹葉片的基因組DNA提取提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

槜李葉片采自浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院古塘基地果樹園區(qū)，采摘后放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-86 ℃超低溫冰箱保存。

1.1.2 試劑

CTAB、SDS、PVP、β-巰基乙醇、EDTA、Tris均購于上海生物工程公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 槜李葉片DNA常規(guī)提取

樣品處理：取0.1 g槜李葉片轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入1顆5 mm鋼珠，準(zhǔn)備12份，經(jīng)液氮速凍后用震蕩破碎儀1 000 r·min-1破碎至粉末狀，分4組，每組3管，4組分別用CTAB法、SDS法、高鹽法和硅膠膜法提取DNA。

CTAB法：破碎后加入CTAB提取液(100 mmol·L-1Tris，50 mmol·L-1EDTA，1.5 mol·L-1NaCl，2% CTAB，1% PVP，1% β-巰基乙醇，pH 8.0)，65 ℃提取，分別用V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)為25∶24∶1和V(氯仿)∶V(異戊醇)為24∶1的溶液抽提上清，用預(yù)冷異戊醇沉淀DNA，70%乙醇漂洗2次，風(fēng)干后加100 μL TE溶解，-20 ℃保存。

SDS法：破碎后加入SDS提取液(100 mmol·L-1Tris，50 mmol·L-1EDTA，0.5 mol·L-1NaCl，2% SDS，1% PVP，1% β-巰基乙醇，pH 8.0)，65 ℃提取，加5 mol·L-1KAc沉淀蛋白等雜質(zhì)，用預(yù)冷異戊醇沉淀DNA，70%乙醇漂洗2次，風(fēng)干后加100 μL TE溶解，-20 ℃保存。

高鹽法：破碎后加入TPS提取液(100 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1EDTA，1 mol·L-1KCl，1% PVP，1% β-巰基乙醇，pH值8.0)，75 ℃提取，上清用預(yù)冷異戊醇沉淀DNA，70%乙醇漂洗1次，風(fēng)干后加100 μL TE溶解，-20 ℃保存。

硅膠膜法：破碎后加入DNA-Silica結(jié)合液(100 mmol·L-1NaAc，20 mmol·L-1EDTA，1.5 mol·L-1NaCl，2% CTAB，1% PVP，1% β-巰基乙醇，pH 6.0)，65 ℃提取，取上清加入純化柱中(含硅膠膜)，靜置片刻，離心后棄廢液，用70%乙醇沖洗2次，風(fēng)干去乙醇，加100 μL TE溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CTAB法純化DNA

硅膠膜法提取DNA濃度較低，不做純化處理。CTAB、SDS、高鹽法凍存DNA各取一管，吸取50 μL，加入4 μL 5 mol·L-1NaCl與6 μL 10% CTAB，混勻后離心，沉淀用體積比3∶1的100 μL TE與5 mol·L-1NaCl混合液重懸，加2體積預(yù)冷乙醇沉淀DNA，用70%乙醇漂洗2次，風(fēng)干后加50 μL TE溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆肹12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)提取方案比較

DNA條帶電泳如圖1，D值見表1。電泳圖中可以看出，CTAB、SDS和高鹽法提取的DNA存在彌散條帶，點(diǎn)樣孔有雜質(zhì)，根據(jù)D值推測(cè)，DNA中可能殘留一些多糖雜質(zhì)。硅膠膜法提取的DNA條帶亮度低，根據(jù)D值推測(cè)，DNA濃度較低，可能殘留多糖雜質(zhì)。

C1～3為CTAB法提取DNA；S1～3為SDS法提取DNA；Y1～3為高鹽法提取DNA；Z1～3為硅膠膜法提取DNA；M為DL2000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；→為基因組DNA所在位置圖1 CTAB、SDS、高鹽和硅膠膜法提取 DNA電泳結(jié)果

樣品濃度/(ng·μL-1)D260/D280D260/D230C1373.1±336.12.10±1.211.86±0.27S1122.9±158.22.13±0.311.66±0.39Y2739.1±256.51.98±0.511.49±0.23Z139.4±13.11.79±0.150.87±0.23

注：C、S、Y、Z分別為CTAB法、SDS法、高鹽法、硅膠膜法提取的DNA。

2.2 CTAB純化效果

純化后的DNA條帶如圖2，D值見表2。圖中可以看出，CTAB、SDS和高鹽法提取的DNA經(jīng)CTAB法純化后，RNA、彌散帶和點(diǎn)樣孔雜質(zhì)均不同程度減少，根據(jù)D值推測(cè)，DNA濃度有所降低，這一方面是純化的損失，另一方面可能是多糖雜等雜質(zhì)的減少，這些雜質(zhì)原本具有一定的吸光值。其中高鹽提取DNA純化后下方彌散帶增加，可能與原樣品雜質(zhì)含量較高有關(guān)。

C為CTAB法提取DNA；Cc為C純化后產(chǎn)物；S為SDS法提取DNA；Sc為S純化后產(chǎn)物；Y為高鹽法提取DNA；Yc為Y純化后產(chǎn)物；→為基因組DNA所在位置圖2 CTAB法純化后DNA電泳結(jié)果

樣品濃度/(ng·μL-1)D260/D280D260/D230純化前純化后純化前純化后純化前純化后C1 099.5731.62.072.151.802.26S990.9465.42.002.071.342.14Y2 558.21 299.51.902.151.402.29

注：C、S、Y分別為CTAB法、SDS法、高鹽法提取的DNA。

3 討論

本研究分別用CTAB、SDS、高鹽和硅膠膜4種方法提取槜李葉片DNA，通過DNA濃度、純度、電泳條帶和可操作性評(píng)價(jià)4種方法。結(jié)果表明：CTAB法提取DNA基因組DNA條帶完整，有雜帶，殘留一定RNA和多糖雜質(zhì)，除蛋白過程需氯仿抽提，操作繁瑣；SDS法電泳條帶與CTAB法相似，多糖殘留較CTAB法多，操作較CTAB法簡(jiǎn)易；高鹽法濃度最高，操作簡(jiǎn)易，但雜質(zhì)多；硅膠膜法DNA操作簡(jiǎn)易，但DNA濃度低，殘留多糖雜質(zhì)。4種方法提取的槜李葉片DNA均存在不同程度的雜質(zhì)污染，尤其是多糖雜質(zhì)，這與前人關(guān)于果樹DNA提取結(jié)果的分析一致[4,8,11,13]。

CTAB是一種表面活性劑，能裂解細(xì)胞，并能與DNA可逆結(jié)合，這種作用受鹽濃度影響：當(dāng)NaCl>1 mol·L-1時(shí)，不能形成復(fù)合物，DNA呈溶解狀態(tài)；當(dāng)NaCl<0.2 mol·L-1時(shí)，DNA與CTAB形成復(fù)合物，呈沉淀狀態(tài)；當(dāng)NaCl在0.3～0.4 mol·L-1時(shí)，CTAB與單鏈核酸結(jié)合效率非常低[14]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，用CTAB純化的DNA產(chǎn)物，能有效去除RNA、彌散帶和多糖雜質(zhì)。DNA提取方法中，CTAB法提取基因組DNA質(zhì)量也較其他方法好，但過程需氯仿抽提，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境均有危害，且操作繁瑣，抽提取上清時(shí)易吸到雜質(zhì)(圖1，C2泳道)，不利于批量提取大量果樹葉片。

高鹽法由高溫裂解、低溫沉淀和乙醇洗滌3個(gè)簡(jiǎn)單步驟組成，僅需要Tris、EDTA、KCl、異丙醇和乙醇5種常規(guī)試劑，操作簡(jiǎn)便，常用于批量提取大量水稻基因組DNA，且DNA質(zhì)量較好，便于后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)開展，但用于槜李等富含多糖的植物基因組DNA提取，產(chǎn)物中雜質(zhì)含量高。

在低pH高鹽環(huán)境下，DNA的磷酸基團(tuán)與硅膠膜表面硅烷醇基團(tuán)之間形成氫鍵，使DNA吸附在硅膠膜表面，硅膠膜法利用這一特點(diǎn)從細(xì)胞裂解液中分離出DNA，絕大多數(shù)DNA提取試劑盒采用了這種方法[15]。但受硅膠膜數(shù)量限制，結(jié)合的DNA總量有限，而且硅烷醇基團(tuán)會(huì)受到一些雜質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，并與DNA一同洗脫，一方面降低得率，另一方面雜質(zhì)含量高，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這點(diǎn)，其中雜質(zhì)從D值推測(cè)主要是多糖。

SDS法用SDS裂解細(xì)胞釋放DNA，因KAc、SDS和蛋白質(zhì)三者在低溫下可形成復(fù)合物沉淀，所以用KAc代替氯仿去除蛋白，提取的DNA與CTAB法比較，電泳結(jié)果相似，多糖雜質(zhì)略多，過程未使用有害試劑，操作較CTAB法簡(jiǎn)單。由于殘留多糖可用CTAB純化法去除，因此可先用SDS法提取槜李葉片DNA，再用CTAB純化法純化，以獲得高質(zhì)量基因組DNA。對(duì)這種組合提取法可進(jìn)一步優(yōu)化，減少操作步驟，更適合批量化提取操作。