辣椒全基因組測(cè)序材料Capsicum annuum cv.CM334再生體系的建立

張根蓮,張 凱,郭廣君,潘寶貴,刁衛(wèi)平,劉金兵,戈 偉,王述彬*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014)

辣椒(Capsicumspp.)屬于再生頑拗型植物,由于基因型特異性與離體培養(yǎng)效率密切相關(guān),迄今為止仍沒(méi)有建立通用的辣椒組織培養(yǎng)再生體系[1]。曹亞從等的研究結(jié)果顯示,2個(gè)辣椒基因型的平均再生率分別為8.19%和10.00%,顯著高于3個(gè)甜椒基因型[2]。龍鳳等發(fā)現(xiàn)9個(gè)辣椒基因型材料的子葉、下胚軸的芽分化頻率差異較大,變化范圍在50%～90%[3]。外植體類(lèi)型對(duì)組織培養(yǎng)再生也有很大的影響。唐亮等研究認(rèn)為辣椒莖尖的再生能力優(yōu)于子葉[4]；Ezura等利用帶有部分胚根和下胚軸的半粒種子獲得了再生植株[5]；但是多數(shù)研究認(rèn)為辣椒子葉的再生能力最強(qiáng),芽誘導(dǎo)率最高可達(dá)100%,芽伸長(zhǎng)率最高可達(dá)50%[6-10]。在芽分化階段,通常在培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)促進(jìn)芽的分化,使用較多的是3-吲哚乙酸(3-indole-acetic, IAA)、6-芐氨基嘌呤(6-benrylaminopurine, 6-BA)[11-12]、玉米素(Zeatin, ZT)、噻苯隆(Thidazuon, TDZ)等[13-14]；另外，添加AgNO3等也可以提高芽誘導(dǎo)率[15]。在芽伸長(zhǎng)階段,通常降低6-BA的濃度,并加入赤霉素(gibberellic acid, GA3)來(lái)促進(jìn)芽的伸長(zhǎng)[16-19]。

在2014年,辣椒CM334(Criollo de Morelos 334)全基因組測(cè)序完成[20],為辣椒基因功能的研究打開(kāi)了新的一頁(yè)。本項(xiàng)目組在前期研究中,以高抗黃瓜花葉病毒(CMV) 辣椒材料PBC688和高感CMV辣椒材料G29建立遺傳群體,鑒定得到1個(gè)抗CMV的主效QTL,命名為qCmr2.1[21]。為了進(jìn)一步分析抗CMV候選基因的功能,需要建立這3個(gè)辣椒基因型的組織培養(yǎng)再生體系,以用于辣椒抗CMV候選基因的分子機(jī)制研究。因此，我們以CM334、PBC688以及G29為試驗(yàn)材料,以子葉和下胚軸為外植體進(jìn)行了辣椒組織培養(yǎng)再生研究。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以3個(gè)辣椒基因型為試驗(yàn)材料。CM334(Capsicumannuum)引自韓國(guó),其果實(shí)為小羊角形,橫徑1.0 cm，縱徑5～6 cm,為辣椒全基因組測(cè)序材料;PBC688(C.frutescens)引自亞洲蔬菜研究發(fā)展中心,其果實(shí)為紡錘形,橫徑0.5 cm,縱徑1.0 cm,高抗CMV;G29(C.annuum)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供,其果實(shí)為燈籠形,橫徑5～6 cm,縱徑6～7 cm,高感CMV。

1.2 無(wú)菌苗的培養(yǎng)

挑取飽滿(mǎn)的辣椒種子,先用70%酒精浸泡30 s,再用2%次氯酸鈉溶液消毒20 min,然后使用無(wú)菌水清洗 5次,播于播種培養(yǎng)基(表1)[16,22-23]上,置于26 ℃、黑暗條件下發(fā)芽1周左右,最后移于溫度26 ℃、光照周期16 h/8 h(晝/夜)條件下培養(yǎng)。

1.3 不定芽的誘導(dǎo)和分化

在培養(yǎng)10～12 d后,剪取幼苗的子葉、下胚軸(子葉切塊長(zhǎng)度和寬度均為0.5 cm,下胚軸切段長(zhǎng)度為1.0 cm),接種在芽分化培養(yǎng)基(表1)[24]上；芽分化培養(yǎng)基中的DJ為辣椒幼苗的提取汁液,并過(guò)濾滅菌[25]。每2周繼代1次,培養(yǎng)條件為溫度26 ℃、光照周期16 h/8 h(晝/夜)。在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)40 d時(shí)統(tǒng)計(jì)不定芽的發(fā)生情況,計(jì)算芽分化率，其公式為：芽分化率=(分化出再生芽的外植體個(gè)數(shù)/外植體個(gè)數(shù))×100%。

表1 辣椒外植體組織培養(yǎng)的再生培養(yǎng)基

1.4 不定芽的伸長(zhǎng)

將經(jīng)過(guò)2～3次芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)后形成的帶莖不定芽切下,轉(zhuǎn)移到芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(表1)[1],每2周繼代1次,培養(yǎng)條件與不定芽的誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)條件相同。在伸長(zhǎng)培養(yǎng)20 d時(shí)統(tǒng)計(jì)不定芽的生長(zhǎng)情況,計(jì)算芽伸長(zhǎng)率，其公式為：芽伸長(zhǎng)率=(外植體上伸長(zhǎng)的再生芽總個(gè)數(shù)/外植體上分化出的再生芽總個(gè)數(shù))×100%。

1.5 生根與移栽

在不定芽伸長(zhǎng)至1.5～2.0 cm時(shí),自基部切下,移植至生根培養(yǎng)基(表1)[25-26],培養(yǎng)條件同不定芽誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)。在植株生根30 d后統(tǒng)計(jì)生根率：生根率=(生根的植株個(gè)數(shù)/外植體個(gè)數(shù))×100%。待植株長(zhǎng)成健壯的小苗后,打開(kāi)瓶蓋煉苗48 h,移植于營(yíng)養(yǎng)缽中,用塑料薄膜覆蓋保濕3 h,置于溫度26 ℃/20 ℃、光照周期16 h/8 h(晝/夜)、相對(duì)濕度60%條件下培養(yǎng),正常管理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對(duì)辣椒再生芽誘導(dǎo)分化的影響

激素配比會(huì)影響辣椒組織培養(yǎng)再生芽的分化效率(表2)。在芽分化培養(yǎng)基中添加5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA, CM334子葉和下胚軸的再生芽數(shù)分別為13個(gè)和5個(gè), G29子葉和下胚軸的再生芽數(shù)分別為3個(gè)和2個(gè), PBC688則無(wú)外植體分化出再生芽。在添加1.0 mg/L IAA+5.0 mg/L 6-BA的基礎(chǔ)上再添加2.0 mg /L ZT,可加快誘導(dǎo)外植體的分化,但形成的葉狀體呈簇狀生長(zhǎng),其上誘導(dǎo)出的帶生長(zhǎng)點(diǎn)的再生芽減少,且后期很難伸長(zhǎng)，因此,CM334和G29分化出再生芽的外植體個(gè)數(shù)減少,但PBC688的1個(gè)下胚軸外植體分化出再生芽，說(shuō)明添加不同濃度的ZT對(duì)于芽的分化無(wú)明顯的促進(jìn)作用。綜上所述，1.0 mg/L IAA和5.0 mg/L 6-BA有利于辣椒外植體再生芽的分化,以MS+5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA作為芽分化培養(yǎng)基, CM334的芽分化率達(dá)到10.74%。

表2 不同激素及其配比對(duì)辣椒子葉與下胚軸再生芽分化的影響

2.2 不同激素配比對(duì)辣椒再生芽伸長(zhǎng)的影響

激素配比對(duì)再生芽伸長(zhǎng)同樣具有重要作用(表3)。在培養(yǎng)基添加0.25 mg/L ZT和0.50 mg/L ZT后芽伸長(zhǎng)率分別為3.53%和2.50%,添加0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA后芽伸長(zhǎng)率為2.63%,均可促進(jìn)再生芽的伸長(zhǎng)。但當(dāng)ZT或者6-BA濃度高于1.0 mg/L時(shí)則抑制再生芽的伸長(zhǎng),導(dǎo)致無(wú)再生芽伸長(zhǎng)。有研究認(rèn)為,在芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加低濃度的細(xì)胞分裂素(ZT或6-BA和IAA組合)和2.0 mg/L GA3可促進(jìn)再生芽的伸長(zhǎng),但是芽伸長(zhǎng)率具有明顯差異[25]。本研究在培養(yǎng)基中同時(shí)添加0.25 mg/L 6-BA、1.0 mg/L IAA和2.0 mg/L GA3后,辣椒芽伸長(zhǎng)率為8.62%;若以0.25 mg/L的ZT替代0.25 mg/L 6-BA和1.0 mg/L IAA組合,則辣椒芽伸長(zhǎng)率僅為2.94%;如果ZT、6-BA的濃度均增加至0.5 mg/L,則芽伸長(zhǎng)率分別為3.03%和10.66%。因此,本研究中促進(jìn)辣椒再生芽伸長(zhǎng)的最優(yōu)激素配比為0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L GA3,而ZT替代6-BA和IAA組合的效果不佳。

2.3 基因型與外植體對(duì)辣椒組織培養(yǎng)再生的影響

利用優(yōu)化后的激素配比對(duì)3個(gè)辣椒基因型進(jìn)行組織再生培養(yǎng),研究結(jié)果表明： CM334的再生能力最強(qiáng),以子葉和下胚軸為外植體時(shí),芽分化率分別為10.74%和4.85%,每個(gè)外植體平均再生芽數(shù)分別為4.23個(gè)和3.00個(gè),芽伸長(zhǎng)率分別為54.54%和53.33%,生根率分別為24.79%和7.76%,最終獲得再生植株38株；高抗CMV基因型PBC688的再生能力居中,獲得13個(gè)伸長(zhǎng)的再生芽,其中1株生根；高感CMV基因型G29為甜椒類(lèi)型,再生能力最差,最終誘導(dǎo)出5個(gè)可伸長(zhǎng)的再生芽,獲得生根植株1株(表4)。

表3 不同激素及其配比對(duì)辣椒再生芽伸長(zhǎng)率的影響

本研究使用3個(gè)辣椒基因型的子葉和下胚軸作為組織培養(yǎng)再生的外植體,子葉外植體的平均分化率為3.70%～10.74%,高于下胚軸外植體的平均分化率。CM334的子葉外植體的分化率為10.74%，生根率為24.79%,均高于下胚軸外植體的,但是兩個(gè)外植體的芽伸長(zhǎng)率無(wú)明顯差異。PBC688和G29的子葉外植體的分化率、芽伸長(zhǎng)率均高于下胚軸外植體的(表4)。

2.4 CM334組織培養(yǎng)植株再生

將CM334的子葉和下胚軸作為外植體,接種于分化培養(yǎng)基MS+5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+5000.0 mg/L DJ+10.0 mg/L AgNO3,在培養(yǎng)7 d左右后外植體傷口處出現(xiàn)淡黃色或白色愈傷組織(圖1A、圖2A)；在培養(yǎng)20 d左右后可見(jiàn)綠色芽點(diǎn)(圖1B、圖2B)；在培養(yǎng)30 d左右后可分化形成帶有生長(zhǎng)點(diǎn)的再生芽或者無(wú)生長(zhǎng)點(diǎn)的葉狀體(圖1C、圖2C)。在培養(yǎng)40 d左右后將帶有生長(zhǎng)點(diǎn)的再生芽切下，接種至伸長(zhǎng)培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+5000.0 mg/L DJ+10.0 mg/L AgNO3,進(jìn)行再生芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)(圖1D、圖2D)。在60 d左右當(dāng)再生芽伸長(zhǎng)至3～5 cm時(shí),將其接種至生根培養(yǎng)基MS+0.2 mg/L IAA+0.1 mg/L NAA,在90 d左右時(shí)生成健壯的根系(圖1E、圖2E)。在小苗根系生長(zhǎng)發(fā)達(dá)后,煉苗15 d后移植至營(yíng)養(yǎng)缽中,進(jìn)行正常栽培管理(圖1F、圖2F)。

表4 不同辣椒基因型外植體的組織培養(yǎng)再生結(jié)果比較

A:開(kāi)始出現(xiàn)愈傷組織;B:形成不定芽或葉狀體;C:不定芽剪切轉(zhuǎn)移至芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中伸長(zhǎng);D:再生芽在伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng);E:再生植株伸長(zhǎng)且形成健壯根系;F:移栽的再生植株。圖1 CM334下胚軸再生體系的建立

A:開(kāi)始形成愈傷組織;B:出現(xiàn)綠色芽點(diǎn);C:分化出不定芽或葉狀體;D:再生芽在伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中伸長(zhǎng);E:再生小苗生成健壯根系;F:移栽的再生植株。圖2 CM334子葉再生體系的建立

3 討論

辣椒再生芽的誘導(dǎo)和分化對(duì)辣椒組織培養(yǎng)再生體系建立起到關(guān)鍵作用。多數(shù)研究認(rèn)為IAA、6-BA、BA、TDZ、ZT等不同配比對(duì)芽分化有誘導(dǎo)作用。余小林等、孫月芳等的研究表明,在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA,辣椒子葉芽分化頻率最高,芽長(zhǎng)勢(shì)最好[27-28]。本研究采用5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA,再生芽的誘導(dǎo)分化數(shù)量大幅提升,這與何曉明和曹冬孫等的研究結(jié)果[29-30]相同。Li研究認(rèn)為ZT可替代IAA+6-BA的組合促進(jìn)再生芽的誘導(dǎo)分化[31]。本研究發(fā)現(xiàn),在芽誘導(dǎo)分化階段,不同濃度的ZT可促進(jìn)形成大量的愈傷組織,但是后期愈傷組織上形成的再生芽很少,只在CM334子葉外植體上誘導(dǎo)形成4個(gè)再生芽(表2)。在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中同時(shí)添加2.0 mg/L ZT與5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA后,可加快誘導(dǎo)外植體的分化,但形成的葉狀體呈簇狀生長(zhǎng),其上誘導(dǎo)出的帶生長(zhǎng)點(diǎn)的再生芽減少,且后期很難伸長(zhǎng)。這一現(xiàn)象在其他研究中未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究中誘導(dǎo)培養(yǎng)基中最佳的激素配比為5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA。

除不定芽的誘導(dǎo)分化外,辣椒離體培養(yǎng)的另一難點(diǎn)在于再生芽的伸長(zhǎng)。曾華等發(fā)現(xiàn)在添加0.5 mg/L 6-BA和1.0 mg/L IAA或者0.2 mg/L IAA和1.0 mg/L ZT的培養(yǎng)基上,同時(shí)添加2.0 mg/L GA3和5.0 mg/L AgNO3對(duì)不定芽的伸長(zhǎng)效果最好[32]。Bairwa等研究發(fā)現(xiàn),芽伸長(zhǎng)階段在MS培養(yǎng)基中添加5.0 mg/L PG (間苯三酚)+0.3 mg/L GA3,不定芽伸長(zhǎng)效果最好[33]。本研究結(jié)果表明：添加0.25 mg/L ZT、0.5 mg/L ZT或者0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA可以促進(jìn)再生芽的伸長(zhǎng),但是芽伸長(zhǎng)率很低;添加1.0 mg/L ZT或者1.0 mg/L 6-BA即可抑制再生芽的伸長(zhǎng),導(dǎo)致無(wú)再生芽伸長(zhǎng)。這與繆武等的研究結(jié)果[34]一致。本研究還發(fā)現(xiàn),在0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA的基礎(chǔ)上添加2.0 mg/L GA3后,芽伸長(zhǎng)率顯著提高。羅素蘭等研究認(rèn)為0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L GA3最利于不定芽的伸長(zhǎng)[35]。因此本研究?jī)?yōu)化的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基激素配比為0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L GA3。

辣椒再生具有嚴(yán)重的基因型依賴(lài)性,導(dǎo)致目前為止還未能建立普適的辣椒再生體系。多數(shù)研究認(rèn)為辣椒基因型(有辣味)不定芽的誘導(dǎo)分化能力高于甜椒基因型(無(wú)辣味)的[1-2,14]。本研究選用3個(gè)辣椒基因型,其中辣椒CM334的生根率達(dá)到24.79%,甜椒G29的再生能力(生根率)僅為0.61%(表4)。這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果[36-37]相符。另外也有研究認(rèn)為,甜椒基因型與辣椒基因型之間的芽分化頻率和芽伸長(zhǎng)率沒(méi)有特定的規(guī)律性[25]。

辣椒離體再生中外植體的類(lèi)型有多種,如子葉、下胚軸、真葉、莖尖、莖節(jié)、根、花藥、原生質(zhì)體、胚等,其中子葉和下胚軸應(yīng)用最為廣泛[9,30,37]。雖然不同外植體均可誘導(dǎo)成功,但是不同類(lèi)型的外植體的再生能力差異明顯。本研究中3個(gè)基因型子葉的再生能力均高于下胚軸的,且下胚軸誘導(dǎo)出的再生芽?jī)H有少量伸長(zhǎng)。這一結(jié)果與Elwan、王玉文、葉志彪等的研究結(jié)果[8,37-38]一致。與之相反的是,有研究認(rèn)為以帶胚根和部分下胚軸的半粒種子作為外植體,不定芽的誘導(dǎo)率最高，超過(guò)95%[39],優(yōu)于以子葉和下胚軸為外植體的[2]。

本研究針對(duì)3個(gè)特定的辣椒基因型進(jìn)行了離體再生培養(yǎng),并對(duì)全基因組測(cè)序材料CM334建立了成熟的離體再生體系,獲得了38株再生植株；雖然高抗CMV和高感CMV基因型的離體再生效率較低,但是也均獲得了1株再生植株,可以滿(mǎn)足后續(xù)候選基因分子機(jī)制研究的需求。尤為重要的是,CM334作為辣椒研究的“模式植物”,其組織培養(yǎng)再生體系的建立為辣椒分子生物學(xué)研究提供了有力的技術(shù)支撐。